熊果酸体内干预对肝星状细胞、肝细胞及枯否细胞NOX表达的影响

发布时间：2019-07-18 21:27

【摘要】：背景:近年研究表明,表达于肝星状细胞(HSCs)、肝细胞(HCs)及枯否细胞(KCs)表面的NADPH氧化酶(NOX)在肝纤维化的发生发展中起重要作用。本课题组前期体内研究发现熊果酸(UA)具有抗肝纤维化作用;体外研究发现UA能阻断HSCs表面的NOX诱导其凋亡;抑制HCs表面的NOX保护HCs。但UA体内对HSCs、HCs及KCs中NOX表达的影响尚不明确。本课题以纤维化大鼠作为研究对象,以加拿大麻素(AP)作为阳性对照,正常大鼠作为空白对照,观察UA干预(预防和治疗)对肝纤维化的逆转作用;明确UA体内抗肝纤维化的机制是否与抑制HSCs、HCs及KCs中NOX的表达相关。目的:观察UA干预后肝纤维化大鼠体内肝星状细胞、肝细胞及枯否细胞表面NOX的表达,探讨UA体内抗纤维化的机制及分子靶点。方法:1.将雄性SD大鼠随机分为6组:空白对照组、肝纤维化模型组、AP预防及治疗组、UA预防及治疗组,其中,肝纤维化组给予四氯化碳(CCl4)灌胃2ml/kg(橄榄油稀释20%浓度)每周两次,共8周;预防组在CCl4灌胃2周后,给予AP或UA(40mg/kg/d)灌胃6周,同时继续CCl4灌胃6周;治疗组在CCl4灌胃8周后,再给予AP或UA(40mg/kg/d)灌胃4周。药物处理结束72h后,获取血、肝脏标本。2.HE染色观察肝小叶结构;天狼星红染色法观察胶原沉积程度;比色法测定血清及肝脏组织羟脯氨酸含量;WB检测肝组织的I型胶原、TGFβ1、MMP-1、TIMP-1和α-SMA的蛋白含量。3.全自动生化仪检测大鼠血清中ALT、ALB、TBIL;IHC检测大鼠肝组织PCNA表达;TUNEL检测肝细胞凋亡。4.WB检测肝组织中NOX1、NOX2及NOX4蛋白表达。5.原位灌注+梯度离心分离原代HSCs、HCs及KCs,RT-qPCR检测三种细胞NOX的mRNA水平。结果:1.熊果酸体内干预对肝纤维化的影响与纤维化组相比,UA预防和治疗组肝脏组织纤维间隔及胶原沉积均减轻,大鼠血清及肝脏组织羟脯氨酸含量显著降低(P0.001);UA预防组肝脏组织中I型胶原、TGFβ1、TIMP-1及α-SMA蛋白表达水平均降低(分别为P0.01,P0.001,P0.01及P0.001);UA治疗组上述指标也降低(分别为P0.001,P0.001,P0.01及P0.001);UA预防和治疗组肝脏组织MMP-1蛋白表达水平升高(P0.01)。2.熊果酸体内干预对肝功能及肝细胞的影响与纤维化组相比,UA预防和治疗组大鼠血清ALT、TBIL水平下降,而ALB水平上升(均为P0.001);肝细胞增殖增加(P0.01),凋亡减少(P0.01)。3.熊果酸体内干预对肝脏组织中NOX蛋白的影响与纤维化组相比,UA预防组肝脏组织中NOX1、NOX2及NOX4蛋白表达均减少(分别为P0.01,P0.01和P0.001);UA治疗组上述指标蛋白表达也减少(分别为P0.001,P0.01和P0.001)。4.熊果酸体内干预对HSCs、HCs及KCs中NOX mRNA的影响4.1熊果酸体内干预对HSCs中NOX mRNA的影响与纤维化组相比,UA预防组HSCs中NOX1、NOX2及NOX4的mRNA水平均下调(分别为P0.01,P0.01和P0.001);UA治疗组上述指标的mRNA水平也下调(分别为P0.001,P0.01和P0.001)。4.2熊果酸体内干预对HCs中NOX mRNA的影响与纤维化组相比,UA预防组HCs中NOX1、NOX2及NOX4的mRNA水平均下降(分别为P0.001,P0.01和P0.001);UA治疗组HCs中NOX2及NOX4的mRNA水平也下降(分别为P0.01和P0.001),而UA治疗组HCs中NOX1的mRNA水平无统计学意义(P0.05)。4.3熊果酸体内干预对KCs中NOX mRNA的影响与纤维化组相比,UA预防组KCs中NOX1、NOX2及NOX4的mRNA水平均下降(均为P0.001);UA治疗组KCs中上述指标的mRNA水平也下降(分别为P0.01,P0.05和P0.001)。结论:熊果酸体内抗肝纤维化机制与其下调肝星状细胞、肝细胞及枯否细胞NOX的表达有关。
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图片说明： 第 2 章 材料与方法2×Super Real PreMix Plus 10μl5×ROX Reference Dye 2μl正向引物 0.5μl反向引物 0.5μlRNase-Free ddH2O 5μlC-DNA 2μl漩涡振荡混匀，短时离心后，置于荧光定量 PCR 仪中95℃ 15min 预变性 1 个循坏95℃ 10s 变性56℃ 20s 退火 40 个循环72℃ 32s 延伸（4）收集实验数据并进行统计分析。（5）扩增曲线及溶解曲线附图，如下。
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图片说明： 95℃ 15min 预变性 1 个循坏95℃ 10s 变性56℃ 20s 退火 40 个循环72℃ 32s 延伸（4）收集实验数据并进行统计分析。（5）扩增曲线及溶解曲线附图，如下。附图 1：NOX1 RT-qPCR 扩增曲线及溶解曲线
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R575.2

【参考文献】

相关期刊论文 前4条

1 欧阳灿晖;朱萱;张q和;戴颖;陈江;何文华;李博;李弼民;;熊果酸对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1和α-SMA表达的影响[J];世界华人消化杂志;2009年22期

2 戴颖;朱萱;;熊果酸抗实验性大鼠肝纤维化作用机制的研究[J];江西医药;2008年05期

3 申月明;朱萱;张昆和;谢勇;陈江;戴颖;欧阳灿辉;李弼民;;熊果酸对肝星状细胞增殖与凋亡的影响[J];中华肝脏病杂志;2008年04期

4 何文华;李博;朱萱;张q和;李弼民;刘志坚;刘戈云;王剑;;NADPH氧化酶在瘦素诱导肝星状细胞株HSC-T6产生活性氧中的作用及其机制[J];中华肝脏病杂志;2010年11期

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本文编号：2516078