中国人群非酒精性脂肪性肝病患者肠道菌群结构的研究

发布时间：2019-07-19 16:42

【摘要】：背景：非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）发病率在全球范围逐年升高，目前研究显示肠道菌群与该疾病有密切的相关性。方法：选取2011年9月至2013年2月在解放军总医院国际医学中心住院体检者，依据2010年修订的非酒精性脂肪性肝病诊疗指南进行诊断。收集入组者空腹外周血及新鲜粪便标本，提取粪便基因组DNA扩增其16S rDNA的V4区，并应用IlluminaMiseq平台测序，分析其肠道菌群结构。结果：本课题共纳入NAFLD患者30例及健康对照37例。经统计分析，组间性别构、年龄、舒张压、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇及谷草转氨酶等无差别。NAFLD组体重指数及腰臀比显著大于对照组（P＜0.001）；甘油三酯（P＜0.001）、谷丙转氨酶（P=0.004）和γ-谷氨酰转肽酶（P=0.012）高于对照组；高密度脂蛋白胆固醇水平显著低于对照（P＜0.001）。病例组空腹血糖和空腹胰岛素水平显著高于相应的对照组结果（分别为P=0.003和P＜0.001），组间HOMA-IR有显著的统计学差异（3.86±2.21vs.1.85±0.94，P＜0.001）。Logistic多元回归显示HOMA-IR是与NAFLD关系最为密切的临床指标（95%CI0.018-0.245，P=0.024）。流式细胞检测显示NAFLD组与健康对照的外周血单核细胞TLR4表达率及TLR4荧光强度无明显差别。最终67例样本共获得有效序列4460840条，平均每样本序列数为66579.70条，有效序列评价读长为252.00bp；使用Uparse软件将相似度大于97%的序列聚类后共获得938个操作分类单元（OTU）。样品内复杂度分析（稀释曲线）显示，随测序数量不断增加，各样本的稀释曲线均趋于平缓；病例组与对照组之间在OTU数量、Chao1指数、Shannon指数等方面均无显著差异。主坐标分析（Principal CoordinateAnalysis，PCA）显示，本研究纳入的67个样本无法以PC1-PC2坐标系将NAFLD和健康对照两类样本完全分开，两类样本可见不同程度的混杂；聚类分析显示， NAFLD和健康对照样本首先在本类样本中实现聚类，然后再与其他样本或聚类进一步合并。 Metastats分析可发现，有8个菌科存在组间统计学差异。此外共发现12个菌属在NAFLD和健康对照组间存在统计学差异，分别是紫单胞菌属、Odoribacter菌、粪球菌属、梭菌属、Blautia菌属、Dorea菌属、消化球菌属、rc4-4菌属、Slackia菌、光冈菌属、琥珀酸弧菌属和变形杆菌属。冗余分析（redundance analysis，RDA）分析显示，TG的Pr值为0.00199，其对于肠道菌群的影响较小；WHR和HOMA-IR的Pr值相同，均为0.005，但HOMA-IR的R2高于WHR（3.394vs.3.363），体现HOMA-IR对于NAFLD的肠道菌群变化有更显著的影响。结论：HOMA-IR是与NAFLD密切相关的临床指标。各样本肠道菌群结构有其独特性，NAFLD与健康对照样本在菌群结构上存在不同程度的重叠，但其趋势是首先实现组内样本聚类。HOMA-IR是与肠道菌群结构联系最密切的临床指标。
【图文】：
所示，横坐标为样本编号，纵坐标显示该样本OTU数量

图 3-2 结果显示 PCR 产物条带清晰，位置与 250bp 标记物接近，符合实验预期，达到 Illumina Miseq 测序平台的检测要求。3.3.2 OTU 的建立Illumina Miseq 所得 16S rDNA 序列（reads）经 Flash 软件拼接重叠序列后，使用QIIME 软件滤除低质量序列。使用 Uparse 软件将相似度大于 97%的序列聚类后共获得 938 个操作分类单元（OTU），各样本 OTU 分布情况见图 4。图 4. 各样本 OTU 分布情况。
显示了67例样本总体的细菌界常见的18个菌门丰度分布，其中丰度最高的

细菌种（species）水平，最大 OTU 数为 411,最小 OTU 数为 251；在菌最大 OTU 数为 266,最小 OTU 数为 164（见辅表 2）。符合下一步与行同源比对和种属分类的要求。操作分类单元 OTU 的比对鉴定于核酸数据库分类（Ribosomal Database Project，RDP）对有效 OT种属分类学鉴定，，统计每个样品在各分类水平上的构成，包括门、纲部分 OTU 可达种的水平。基于每个样本中物种的丰度水平，实现类地位聚类，显示样品中聚集较多的物种。图 5. 67 例样本总体细菌分布情况。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575.5

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