肝纤维化发生发展中肝血窦内皮细胞间质样转分化现象的发现及其调控机制研究

发布时间：2019-10-17 21:23

【摘要】：【研究背景】肝纤维化是肝脏长期遭受慢性损伤因素刺激后所发生的以细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)异常沉积为主要特征的病理变化。肝纤维化发生发展过程中ECM主要由活化的肌成纤维母细胞产生,但目前针对肌成纤维母细胞的来源问题一直存在争议。肝血窦内皮细胞(Liver Sinusoidal Endothelial Cells,LSECs)是肝脏组织特异性的血管内皮细胞,其特异性主要表现为细胞表面具有丰富的窗孔结构以及血管内皮基底膜的缺失。虽然肝血窦特异性周细胞——星型细胞(Hepatic Stellate Cells,HSCs)目前被认为是肌成纤维母细胞的主要贡献者,但既往文献报道血管内皮细胞也能够通过内皮间质转分化(Endothelial Mesenchymal Transition,EnMT)过程转化为肌成纤维母细胞并参与到多种组织器官的纤维化进展当中,而LSECs作为肝脏组织中数量最大的一类非实质细胞,其在肝纤维化发生发展过程中是否具有转分化为肌成纤维母细胞样细胞的能力并参与促进肝纤维化,是值得进一步研究的问题。Notch信号通路对血管发育、血管新生、血管功能和组织器官稳态发挥着关键调控作用。既往文献表明,Notch信号是血管内皮细胞发生EnMT的始动因素之一,并且Notch信号能够通过介导内皮细胞发生EnMT而参与心脏的发育过程。包括我们课题组在内的前期研究发现,血管特异性Notch信号在维持肝脏血管正常结构、血管旁分泌功能和急性肝损伤后的血管重塑过程中发挥关键角色。而在慢性损伤因素导致的肝纤维化发生发展过程中,LSECs特异性的Notch信号如何变化,以及Notch信号是否会通过调控LSECs的EnMT参与纤维化的发生发展,尚不清楚。【目的】明确在肝纤维化发生发展过程中,LSECs是否会通过EnMT转分化为肌成纤维母细胞样的细胞而参与肝纤维化;阐明LSECs特异性Notch信号是否在其EnMT过程中起到关键调控作用。【方法】1.分离提取小鼠原代LSECs并鉴定,在其体外培养过程中,观察毛细血管化的(Capilarized)LSECs是否存在EnMT样转变。2.建立小鼠肝纤维化模型,通过免疫荧光染色观察肝纤维化发生发展过程中LSECs与间质样细胞标志物的共定位情况。3.分离提取小鼠肝纤维化不同阶段的LSECs,在mRNA和蛋白水平检测纤维化过程中LSECs特异性EnMT标志物的变化情况。4.通过遗传示踪小鼠模型验证肝纤维化病理过程中LSECs的EnMT现象,并通过流式细胞技术在单细胞层面证实LSECs能够作为肌成纤维母细胞的前体细胞之一,在纤维化过程中获得肌成纤维母细胞样的特征。5.分离静息和纤维化条件下的HSCs和LSECs,通过全转录组测序的方法从基因表达谱层面验证LSECs在EnMT发生过程中获得了肌成纤维母细胞样特征,并对比其与传统HSCs来源肌成纤维母细胞的异同。6.通过免疫荧光染色等技术,在临床肝硬化样本中对LSECs的EnMT现象进行验证。7.通过mRNA和蛋白水平的检测,观察纤维化发生发展过程中LSECs特异性Notch信号的变化情况。8.构建内皮细胞特异性Notch信号激活/阻断小鼠模型,观察内皮特异性Notch信号激活/阻断对小鼠肝纤维化、LSECs毛细血管化以及LSECs EnMT的影响。9.在体外水平,通过使用Notch信号阻断剂阻断培养过程中LSECs的Notch信号,观察其对体外LSECs自发性EnMT的挽救作用。10.在体内外水平,通过使用可溶性鸟苷酸环化酶(Soluble Guanylate Cyclase,sGC)激动剂,抑制LSECs在体外培养和体内肝纤维化过程中发生的毛细血管化,观察LSECs的成熟分化状态对EnMT的影响,初步探索LSECs的EnMT与毛细血管化现象的相关性。【结果】1.我们通过免疫磁珠分选(Magnetic Activated Cell Sorting,MACS)的方法成功从小鼠肝脏分离提取出原代LSECs,经FACS验证所提取的LSECs 99.7%为VEGFR3~+CD34~-,体外培养贴壁的LSECs光镜下形态均一,细胞具有吞噬甲醛化白蛋白(Formaldehyde-treated Serum Albumin,FSA)和乙酰化低密度脂蛋白(Acetyl Low Density Lipoprotein,acLDL)的能力,扫描电镜(Scanning Electron Microscope,SEM)观察到细胞表面拥有特征性的窗孔结构。在LSECs体外培养过程中我们观察到毛细血管化的LSECs逐渐呈现出长梭形间质样细胞的形态,通过mRNA水平和蛋白水平的检测发现毛细血管化的LSECs表达出明显的间质样细胞标志物——如α平滑肌动蛋白(alpha Smooth Muscle Actin,a-SMA)、平滑肌22α(Smooth Muscle 22 alpha,Sm22)和I型胶原(Type I Collagen,Col-1)等。2.我们在野生C57小鼠上建立了CCl_4肝纤维化模型,SEM下可见LSECs在损伤早期、胶原纤维出现之前即发生毛细血管化,与文献报道相同。通过免疫荧光染色观察到,在纤维瘢痕沉积的汇管区以外区域,存在明显LSECs与肌成纤维母细胞标志物a-SMA、Sm22和Col-1的共定位,并且这种共定位现象在静息状态下就存在,而且在肝损伤早期便会大量出现。此外,我们在胆管结扎(Bile Duct Ligation,BDL)肝纤维化模型中也验证了这种共定位现象。3.进一步我们分离了纤维化不同时间点的LSECs,通过mRNA水平和蛋白水平的检测,证实了随着纤维化的进展,LSECs中的肌成纤维母细胞样标志物出现明显升高,并且这些间质样标志物在静息态LSECs中便能够被检测到,而在肝损伤发生后表达立刻升高。4.为进一步明确纤维化过程中LSECs的EnMT现象,我们构建了Cdh5~(Cre)ROSA-YFP~(stop/flox)遗传示踪小鼠,在此小鼠的基础上建立CCl_4和BDL肝纤维化模型,通过激光共聚焦同样追踪到YFP+LSECs与肌成纤维母细胞样标志物的共定位。随后我们分离了对照组和纤维化组Cdh5~(Cre)ROSA-YFP~(stop/flox)小鼠的LSECs,通过FACS检测,我们在单细胞水平证实了静息态YFP~+LSECs作为一种具有肌成纤维母细胞样特征的前体细胞,在肝纤维化时能够发生EnMT。5.将静息和纤维化条件下的HSCs和LSECs进行分离后测序,在表达谱层面,通过主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)我们发现LSECs通过EnMT途径转变而来的肌成纤维母细胞与传统意义上HSCs活化而来的肌成纤维母细胞属于不同的细胞亚群,但两者在肌成纤维母细胞活化相关基因的表达模式上存在相似性。6.通过对临床肝硬化患者硬化肝脏标本的免疫荧光染色,我们同样证实了人LSECs在肝硬化背景下也能够发生EnMT,并且天狼猩红染色结果提示——发生EnMT的LSECs可能与血窦性纤维化关系更密切。7.在mRNA水平和蛋白水平,我们通过对纤维化不同时间点LSECs Notch信号下游靶分子Hes1和Hey1的检测发现,LSECs中的Notch信号在损伤早期被抑制,但随着损伤因素的持续刺激,LSECs中的Notch信号被持续活化,提示Notch信号的激活有可能参与LSECs的EnMT过程。8.为进一步研究Notch信号在LSECs EnMT中的作用,我们构建了Cdh5~(CreERT) ROSA26-N1ICD~(stop/flox)内皮特异性Notch信号激活转基因小鼠和Cdh5~(Cre)ERTRBP-j~(flox/flox)内皮特异性Notch信号阻断转基因小鼠,通过建立CCl_4肝纤维化模型,我们发现,内皮细胞中激活Notch信号加重了小鼠的肝纤维化、肝血窦毛细血管化和LSECs的EnMT;相反,内皮细胞中阻断Notch信号能够减弱肝血窦毛细血管化和LSECs的EnMT,但其并未能显著减轻肝纤维化程度。9.在体外培养的LSECs中,我们通过GSI阻断Notch信号后发现,Notch阻断能够挽救LSECs体外培养过程中的自发性EnMT现象,表现为细胞的间质样形态变化被抑制以及肌成纤维母细胞样标志物表达的减少。10.为阐明LSECs的EnMT与毛细血管化的关系,我们对体外培养的LSECs给予sGC激动剂YC-1处理后发现,YC-1在抑制LSECs发生毛细血管化的同时,也抑制了LSECs自发性EnMT的发生;同时YC-1在体内能够减轻小鼠的肝纤维化程度并改善肝损伤。以上结果提示EnMT与毛细血管化有可能是LSECs的同一病理过程在不同层面的定义,阻止LSECs EnMT的发生是治疗肝纤维化的有效手段之一。【结论】1.LSECs作为一种潜在的肌成纤维母细胞的前体细胞,在肝纤维化发生发展过程中能够通过EnMT转变为肌成纤维母细胞。2.Notch信号通路参与调控了LSECs的EnMT病理过程。3.LSECs的EnMT与毛细血管化可能是同一种病理变化,阻断LSECs发生EnMT有可能成为抑制肝纤维化的有效手段。
【图文】：

肝小叶结构示意图

图 1. 肝小叶结构示意图图 2. 肝血窦结构示意图2. 肝血窦内皮细胞LSECs 是肝脏非实质细胞群中数量最大的一群细胞，约占整个肝脏体积的 3%，所有肝脏细胞数量的 15%-20%，，而在非实质细胞数量中占 50%以上，是构成肝血窦
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R575.2


本文编号：2550776