【摘要】：目的:为了获得高纯度的眼镜蛇毒细胞毒素-4N(Cytotoxin-4N,CTX-4N),探索眼镜蛇毒中细胞毒素-4N对大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC-T6)的增殖抑制作用和CTX-4N通过ERK信号通路对HSC-T6细胞凋亡的影响,从而阐明CTX-4N通过ERK信号通路诱导肝星状细胞凋亡的机制。方法:采用DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱、SpehadexG-50凝胶层析柱、Macro-prep High S阳离子交换柱结合的方法对眼镜蛇毒蛋白进行分离纯化。采用HSC-T6增殖抑制实验对每一步分离后的各峰蛋白CTX-4N进行活性检测。收集活性最强的蛋白峰,在用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其纯度。采用蛋白质谱法鉴定其成分及分子量大小。用CCK-8方法检测不同浓度的CTX-4N对HSC-T6的增殖抑制作用。采用流式细胞术检测CTX-4N对HSC-T6细胞凋亡的影响。采用Western-Blot检测CTX4-N作用HSC-T6细胞不同时间后,ERK信号通路中ERK1/2的磷酸化水平的变化;以及在加入抑制剂PD98059处理HSC-T6细胞后,ERK信号通路中ERK1/2磷酸化水平的变化。抑制剂实验分组:空白对照组、CTX-4N组、抑制剂组和CTX-4N+抑制剂组。结果:通过DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱、SpehadexG-50凝胶层析柱、Macro-prep High S阳离子交换柱分离纯化后得到一个电泳纯度的蛋白,蛋白质谱鉴定为CTX-4N,分子量约为9.605 KDa。不同浓度的CTX-4N对HSC-T6细胞具有增殖抑制作用,随着浓度的增加而增强,最小抑制浓度为2μg/mL,呈剂量-效应关系,IC50为(12.836±0.045)μg/mL。不同浓度的CTX-4N对HSC-T6细胞的凋亡作用随着浓度的增加而增强,且诱导HSC-T6凋亡的最小浓度为4μg/mL。以4μg/mL的CTX-4N作用HSC-T6不同时间后,各时间点的ERK1/2蛋白表达没有变化,而磷酸化ERK1/2蛋白的表达一开始是随着作用时间的延长而表达增加,作用10min后磷酸化ERK1/2表达水平最高,随后就开始降低,到60min后其表达低于对照组(P㩳0.05)。以10μmol/L的PD98059和4μg/mL的CTX-4N作用HSC-T6细胞后,ERK1/2蛋白的表达没有发生改变,而可以显著的抑制磷酸化ERK1/2的表达。结论:广西眼镜蛇毒通过DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱、SpehadexG-50凝胶层析柱、Macro-prep High S阳离子交换柱分离纯化获得电泳纯度的CTX-4N。CTX-4N能使HSC-T6细胞发生凋亡作用,对ERK信号通路中的磷酸化ERK1/2表达具有抑制作用,因此,CTX-4N可能通过ERK信号通路诱导HSC-T6凋亡,来干预肝纤维化的发生和发展。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R575.2
【参考文献】
相关期刊论文 前7条
1 Denise C Paranaguá-Vezozzo;Adriana Andrade;Daniel F C Mazo;Vinicius Nunes;Ana L Guedes;Taisa G Ragazzo;Renata Moutinho;Lucas S Nacif;Suzane K Ono;Venancio A F Alves;Flair J Carrilho;;Concordance of non-invasive mechanical and serum tests for liver fibrosis evaluation in chronic hepatitis C[J];World Journal of Hepatology;2017年08期
2 王永周;夏纪毅;唐小平;唐利;毛熙光;张宇骄;喻小兰;;黄芩素通过抑制胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)促进HeLa细胞凋亡[J];细胞与分子免疫学杂志;2016年11期
3 张迎征;和七一;邓秋平;余晓东;;眼镜蛇属(Naja)毒液的主要功能组分研究进展[J];延安大学学报(自然科学版);2016年01期
4 李鑫;朱文浩;高颖;;ERK1/2通路及其介导多发性硬化发病的研究进展[J];世界科学技术-中医药现代化;2015年04期
5 张锦宏;曾军;谢天炽;郭芝刚;;眼镜蛇毒细胞毒素对S180荷瘤小鼠抗肿瘤作用的研究[J];中国医学创新;2012年20期
6 陈建勇;王聪;王娟;曹礼荣;;MAPK信号通路研究进展[J];中国医药科学;2011年08期
7 蒋明德,马洪德,解方为,钟显飞,曾维政,秦建平,徐辉;细胞外信号调节激酶调控乙醛对肝星状细胞的影响[J];中华消化杂志;2003年12期
，
本文编号：
2566313
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/xiaohjib/2566313.html
