【摘要】： 炎症性肠病(IBD)是一组累及胃肠道的慢性非特异性炎症性疾病,主要包括溃疡性结肠炎(UC)和Crohn病(CD)。大量研究表明免疫反应尤其是自身免疫反应参与IBD的发病。IBD患者对肠腔抗原失去耐受,产生免疫应答,体内对肠腔抗原的抗体水平增高。因此,研究口服耐受对治疗IBD具有重要的指导意义。多次低剂量口服抗原主要通过调节性T细胞分泌抑制性细胞因子来介导免疫抑制。已有报道口服五剂低剂量结肠炎提取蛋白(CEP)或正常结肠蛋白(NCEP)对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导结肠炎有预防及治疗作用,但正常结肠蛋白的作用稍差,耐受诱导是由抑制性细胞因子如TGF-β1、IL-4、IL-10等所介导。 γδT细胞倾向性分布于上皮组织。日益增多的证据表明γδT细胞能发挥多种免疫调节功能。它们诱导对感染或转化细胞的溶细胞效应,支持粘膜IgA生成,维持上皮的自稳。γδT细胞亦在口服耐受中发挥关键的调节作用。然而,关于γδT细胞在炎症过程中有利及有害的作用均有报道,在IBD患者及动物模型中的作用多年来存在争议,而且关于肠粘膜γδT细胞在口服耐受干预结肠炎过程中所起的作用尚未明确。CD8+T细胞在肠粘膜中相当丰富,尤其是上皮层。已有报道CD8+调节性T细胞对IBD的抑制效应。口服耐受能诱导产生脾CD8+调节性T细胞。但对肠粘膜CD8+T细胞在口服耐受中的作用研究甚少。 因此,本课题以多次低剂量口服CEP对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导BALB/c小鼠结肠炎的预防模型为基础,利用流式细胞术检测T细胞亚群CD8α+和TCRγδ+T细胞在肠相关淋巴组织(GALT)及脾中的改变,探讨T细胞亚群在DSS诱导结肠炎中的作用以及T细胞亚群在口服耐受干预结肠炎中的作用,同时过继转移来自未处理小鼠或口服耐受处理小鼠的小肠上皮内淋巴细胞(SI-IEL)及经磁性活化细胞分选技术(MACS)分选的SI-γδIEL,观察受体鼠结肠炎的症状及组织学病变,并初步探索细胞作用的机制,为IBD的发病机制及临床治疗提供新的依据。 第一部分小鼠结肠炎的改善与结肠粘膜中CD8α+和TCRγδ+T细胞增多相关 为建立BALB/c小鼠结肠炎,予7周龄雄性小鼠自由饮用4%DSS,每日监测疾病活动指数(DAI),7日后取脾曲至肛门的肠段用于组织学评分。结果表明结肠炎小鼠的第7日疾病活动指数和组织学评分均较未处理对照鼠显著升高。 取结肠炎诱导7日后小鼠的结肠标本,制备结肠炎提取蛋白(CEP)。以每只200μl 1.25 mg/ml CEP灌胃6周龄小鼠,隔日1次,共5次。以等浓度等量牛血清白蛋白(BSA)灌胃为对照。于末次灌胃后休息3天开始用4%DSS诱导结肠炎,评估两组小鼠(每组12只)的疾病活动指数及病理学改变。从结肠炎诱导第4日至第7日,口服CEP结肠炎小鼠的DAI显著低于口服BSA结肠炎小鼠。两组的组织学评分具有显著性差异(33.6±2.8 vs 25.4±5.0,p0.01),表明口服五次低剂量CEP能缓解DSS诱导的结肠炎。Spearman分析显示组织学评分与第7日疾病活动指数相关(r=0.78,p0.01)。 收集未处理小鼠、结肠炎小鼠、口服CEP结肠炎小鼠、口服BSA结肠炎小鼠的血清,ELISA法检测血清中TGF-β1和IFN-y的浓度。结果示结肠炎小鼠血清中的TGF-β1浓度低于未处理鼠,与口服BSA对照鼠相比,口服CEP结肠炎小鼠血清中的TGF-β1有2至3倍的增加。然而,血清IFN-y浓度在各组小鼠之间未见明显差异。 然后,我们重建结肠炎模型、口服CEP模型及对照组(每组8只小鼠),提取小肠(SI)和大肠(LI)的上皮内淋巴细胞(IEL)、固有层淋巴细胞(LPL)、脾细胞、派氏集合淋巴结(PP)及肠系膜淋巴结(MLN)的淋巴细胞,利用流式细胞术检测各组小鼠中CD3+、TCRγδ+, CD8a+和CD8a+TCRγδ+T细胞的改变。 与未处理组相比,结肠炎小鼠SI-IEL和SI-LPL的TCRγδ5+和CD8a+TCRγδ+T细胞的比例增加,相应的TCRγδ-T细胞和CD8a+TCRγδ-T细胞的比例降低。与口服BSA结肠炎对照组相比,口服CEP结肠炎小鼠LI-IEL和LI-LPL的TCRγδ+T细胞、CD8α+TCRγδ+T细胞、CD8α+T细胞和CD8α+TCRγδ-T细胞的比例均增加,相应的TCRγδ- T细胞和CD8αTCRγδ-T细胞的比例降低。第7日的DAI与大肠粘膜中CD8α+T细胞或TCRγδ+T细胞的百分比之间呈负相关(p均小于0.05)。 口服CEP结肠炎小鼠的结果表明结肠炎的改善伴随大肠粘膜淋巴细胞中CD8α+T细胞和TCRγδ+T细胞的增多,因此我们检测DSS处理终止5日的修复期小鼠的肠粘膜淋巴细胞。与未处理对照组相比,结肠炎修复期小鼠LI-IEL和LI-LPL的TCRγδ+T细胞、CD8α+TCRγδ+T细胞、CD8α+T细胞和CD8α+TCRγδ-T细胞的比例均增加,相应的TCRγδ- T细胞和CD8α-TCRγδ-T细胞的比例降低。 口服CEP结肠炎小鼠脾淋巴细胞中CD8α+T细胞的比例高于口服BSA结肠炎小鼠。PP的CD3+T细胞在结肠炎小鼠中的比例高于未处理鼠,CD8α+T细胞的比例亦增多,口服CEP结肠炎小鼠的PP中CD3+T细胞和CD8α+T细胞的比例均低于口服BSA结肠炎小鼠。与PP中细胞的变化模式相反,MLN的CD3+T细胞在结肠炎小鼠中的比例低于未处理鼠,CD8α+T细胞的比例亦减少,口服CEP结肠炎小鼠的肠系膜淋巴结中CD3+T细胞和CD8α+T细胞的比例均高于口服BSA结肠炎小鼠。 总之,口服多次低剂量CEP能缓解DSS诱导的结肠炎,口服抗原致结肠炎的改善与大肠粘膜淋巴细胞中CD8α+T细胞和TCRγδ+T细胞的比例增多相关,修复期粘膜的修复也伴随大肠粘膜淋巴细胞中CD8α+T细胞和TCRγδ+T细胞比例的增多,提示肠粘膜CD8α+T细胞和TCRγδ+T细胞在DSS诱导结肠炎中具有保护性调节作用。口服耐受诱导脾淋巴细胞中CD8α+T细胞增多。PP与MLN中的T细胞在DSS诱导结肠炎及口服耐受中发挥不同的作用。 第二部分小肠上皮内γδT细胞的提纯 γδT细胞在外周血及大多数淋巴器官中比例较少,但富集于上皮组织如肠上皮内,该部分主要建立BALB/c小鼠小肠上皮内γδT细胞的提纯过程。 取BALB/c小鼠的小肠,外翻并振荡,以离散上皮组织。在一部分实验中,细胞悬液直接用40%／70%不连续Percoll离心,在另一部分实验中,离散上皮首先用10ml的30%Percoll离心,去除大部分上皮细胞,然后用40%／70%不连续Percoll离心。利用两步Percoll离心获取SI-IEL的总过程耗时约2小时,而一步提纯法则缩短半小时左右时间。对每组8份提取细胞的分析显示：一步40%／70%Percoll离心后纯度约88.8%,两步30%/40%/70% Percoll离心后纯度约93.2%,两组之间存在显著性差异,污染的细胞主要为上皮细胞。然而在细胞量方面未见明显差异,一步Percoll离心后细胞产量为0.81-1.48×107不等,平均1.141×107细胞,两步Percoll离心后细胞产量为0.92-1.34×107不等,平均1.123×107细胞。利用三色流式细胞术检测SI-IEL中CD3+、TCRγδ+、CD8a+和CD8a+TCRγδ+T细胞的比例。SI-IEL主要由T细胞构成,而且绝大多数是CD8a+T细胞。CD3+T细胞中,TCRyγδ+T细胞占了较高的比例,大约占30-50%, TCRγδ+T细胞中大约90%是CD8a+的。两种Percoll提纯的细胞也被用于流式检测,结果表明两组之间细胞亚群的构成无显著差异。 利用MACS分选两步Percoll提纯的SI-IEL中的γδT细胞。在这个过程中,抗体和微珠的量需要经过优化处理,以获得足够的纯度和产量。实验结果显示1.5×107细胞用3μg PE-conjugated anti-TCRδ-chain抗体染色,45μl anti-PE微珠分选能获得95%以上的纯度。经包被的anti-CD3ε抗体刺激,SI-IEL比分选的γδT细胞分泌更多的IFN-y和TGF-β1,γδT细胞产生中等量的TGF-β1和极少量的IFN-γ。 总之,我们建立的SI-IEL分离程序是可依赖的简单的方法,获得的细胞纯度高及细胞量多。利用一步40%/70% Percoll提纯法可以少费力,足以用于细胞亚群的表型分析。先用10 ml的30% Percoll离心再用40%/70% Percoll提纯法获得的细胞适合用MACS技术分选出γδT细胞,从而为表型及功能研究奠定基础。 第三部分小肠上皮内淋巴细胞对葡聚糖硫酸钠诱导小鼠结肠炎的保护作用 为进一步研究SI-IEL及γδT细胞对DSS诱导小鼠结肠炎的作用,来自未处理鼠、结肠炎鼠、口服CEP结肠炎鼠及口服BSA结肠炎鼠的SI-IEL 3×106或SI-γδIEL 9×105重悬在150μl PBS中,通过尾静脉注射至受体鼠(每组8只),以注射PBS作为空白对照组,然后受体鼠自由饮用4%DSS 7日以诱导结肠炎,评估受体鼠的DAI和组织学评分。结果显示来自未处理小鼠及结肠炎小鼠的SI-IEL或分选的γδT细胞的转移均能缓解受体鼠的结肠炎,来自口服CEP及BSA结肠炎小鼠的小肠上皮内淋巴细胞或分选的γδT细胞的转移均能缓解受体鼠的结肠炎,来自口服CEP结肠炎鼠的SI-IEL的保护效果强于来自口服BSA结肠炎小鼠的SI-IEL.转移各种SI-IEL的受体结肠炎鼠的DAI及组织学评分在第7日与转移SI-γδIEL的受体结肠炎鼠相比均有所减少,但未达到统计学意义。 经包被的anti-CD3ε抗体刺激,来自口服CEP结肠炎鼠的SI-IEL和分选的γδT细胞比来自口服BSA结肠炎鼠的细胞分泌更多的TGF-β1。来自未处理鼠与结肠炎鼠之间、来自口服CEP与口服BSA结肠炎鼠之间的SI-IEL和γδT细胞分泌的IFN-γ无显著差异。细胞转移的受体鼠用于检测血清中TGF-β1和IFN-y的水平。与PBS对照组相比,细胞的转移包括来自未处理鼠、结肠炎鼠、口服CEP结肠炎鼠、口服BSA结肠炎鼠的SI-IEL或分选的γδT细胞,均引起受体鼠血清中TGF-β1水平提高2-3倍。血清TGF-β1的浓度与结肠炎体重下降百分比或组织学评分呈负相关(r=-0.762和r=-0.770,p=0.002和p=0.002)。转移口服CEP结肠炎鼠SI-IEL的受体鼠比转移口服BSA结肠炎鼠SI-IEL的受体鼠拥有更高浓度的TGF-β1 (p=0.04).血清IFN-γ在细胞转移受体鼠与PBS对照组之间均无明显差异。体外培养显示SI-IEL对anti-CD3s抗体和ConA刺激均无明显增殖。 总之,SI-IEL及分选的γδT细胞对DSS诱导的BALB/c小鼠结肠炎具有保护作用,口服耐受加强了SI-IEL中调节细胞亚群的抑制效应,包括γδT细胞。TGF-β1最可能介导这一抑制效应。口服免疫耐受、调节性T细胞与免疫抑制因子对人类IBD的治疗潜能是下一步研究的重点。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R574.4
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2592433
