抗纤软肝方联合熊去氧胆酸防治非酒精性脂肪肝纤维化临床及机制研究

发布时间：2020-03-21 02:06

【摘要】：研究背景及目的非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指无过量饮酒史,以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征。其疾病谱随病程主要包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝纤维化和肝硬化。其中,纤维化阶段是肝相关疾病死亡率的最高阶段。因此,早期采取有效的治疗手段非常重要。2018年NAFLD防治指南(中华医学会肝病分会脂肪肝和酒精肝肝病学组)指出:存在NASH或进展性肝纤维化需要应用护肝药物(熊去氧胆酸等),但其治疗周期长、疗效仍需进一步临床试验证实。2017年NAFLD中西医结合诊疗共识(中国中西医结合学会消化系统疾病专业委员会)指出:存在肝损伤或者进展性肝纤维化者,应加用护肝和抗纤维化药物(熊去氧胆酸、安络化纤丸、扶正化瘀胶囊等),中西医结合治疗可以改善生活质量,提高临床疗效。近年来的基础实验及临床研究发现,中医药在防治肝纤维化有独特的效果。遵循配伍组方规律的验方--抗纤软肝方,前期研究表明,可以显著改善慢性乙型病毒性肝炎肝纤维化及肝硬化患者的临床症状与肝功能、肝纤维化指标。同时在临床应用中,我们发现其联合熊去氧胆酸对非酒精性脂肪肝纤维化亦有较好的疗效,但其治疗NAFLD肝纤维化缺乏系统性临床对照研究,相关机制尚不明确。因此,本研究目的一是对比熊去氧胆酸单药,抗纤软肝方联合熊去氧胆酸的疗效和安全性。二是对比安络化纤丸联合熊去氧胆酸,抗纤软肝方联合熊去氧胆酸疗效是否更具优势。三是对NAFLD肝纤维化不同中医证型的疗效。四是防治NAFLD肝肝纤维化作用机制。为临床应用提供理论基础。研究方法本研究分为临床研究和动物实验研究两大部分。临床研究采用回顾性研究方法,对同时符合纳入标准和排除标准确诊为非酒精性脂肪肝病的患者按用药情况分为三组:A组:口服抗纤软肝方联合熊去氧胆酸;B组:口服安络化纤丸联合熊去氧胆酸;C组:单用熊去氧胆酸。分别分析三组患者治疗前后肝功能、肝纤四项、Child-Pugh分级、脾脏彩超、中医症候积分以及A组不同中医证型症候积分差异。动物实验分为两个部分,实验一:将56只SPF级Wistar大鼠自适应喂养一周后,随机分成7组,每组8只。(1)对照组(Control,CTRL);(2)模型组(Model,MOL);(3)扶正化瘀组(Fuzheng huayu,FZHY);(4)秋水仙碱组(Colchicine,COL);(5)正常剂量抗纤软肝方组(Normal Kangxian ruangan,N-KXRG);(6)中剂量抗纤软肝方组(Middle Kangxian ruangan,M-KXRG)和(7)高剂量抗纤软肝方组(High Kangxian ruangan,H-KXRG)。其中对照组大鼠正常投喂MCS对照饲料,而模型组及5个药物预处理组的大鼠均投喂MCD饲料。在正常投喂饲料的同时,各组大鼠均进行对应药物灌胃处理:(FZHY组:15 g/kg/d;COL组:0.1 mg/kg/d;N-KXRG组:9.2 g/kg/d;M-KXRG组:18.4 g/kg/d;H-KXRG组:36.8 g/kg/d),而对照(CTRL)组和模型(MOL)组大鼠做对照药物处理(均行2 m L/100g/d生理盐水灌胃)。整个过程持续8周。8周后,分别检测各组大鼠血清中各生化指标(丙氨酸转氨酶ALT、天冬氨酸转氨酶AST、γ-谷酰胺转酞酶GGT、总胆固醇CHOL以及甘油三酯TG)的水平;ELISA分别检测大鼠血清中透明质酸(HA)、层连蛋白(LN)、IV-胶原蛋白(IV-C)、III-前胶原蛋白(PC-III)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及白细胞介素-10(IL-10)的分泌水平;苏木精-伊红(HE)染色和马森(Masson)染色检测各组大鼠肝组织病理学变化;TUNEL染色检测各组大鼠肝组织中肝细胞凋亡情况;Western blotting检测肝组织中线粒体凋亡信号通路上的相关蛋白(Caspases家族及Bcl-2家族)的表达量。实验二:30只SPF级Wistar大鼠自适应喂养一周后,被随机分为3组(每组10只):(1)对照组(Control,CTRL);(2)模型组(Model,MOL);(3)抗纤软肝方组(Kangxian ruangan,KXRG)。其中对照组大鼠正常投喂MCS对照饲料,而模型组及KXRG药物预处理组的大鼠均投喂MCD饲料。在正常投喂饲料的同时,各组大鼠均进行对应药物灌胃处理(KXRG组:36.8 g/kg/d),对照(CTRL)组和模型(MOL)组大鼠做对照药物处理(均行2 m L/100g/d生理盐水灌胃)。整个过程持续8周。8周后,ELISA检测各组大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及白细胞介素-6(IL-6)的分泌水平;苏木精-伊红(HE)染色检测各组大鼠肝组织病理学变化;Western blotting检测TGF-β信号通路上的相关蛋白(TGF-β1、TGF-β2、Smad2、Smad3和Smad7)以及TLR4信号通路上相关蛋白(TLR4、My D88和NF-κB)的表达量。研究结果1.临床研究结果1.1三组患者临床综合疗效比较:A组总有效率90%,B组总有效率80%,A组与C组、B组与C组比较,差异有统计学意义(P0.01)。A组总有效率高于B组,但差异无统计学意义(P0.05)。1.2三组患者生化指标比较:丙氨酸氨基转移酶(ALT)和总胆红素(TBil):三组治疗前后差异有统计学意义(P0.01)。A组和B组治疗后与C组治疗后比较差异有统计学意义(P0.01)。谷氨酰转肽酶(GGT):三组治疗前后比较差异有统计学意义(P0.01)。三组治疗后比较差异无统计学意义(P0.05)。1.3三组患者肝纤维化指标比较:透明质酸(HA)和IV型胶原(IV-C):三组治疗前后差异有统计学意义(P0.01)。三组治疗后下降幅度依次为:A组B组C组,并且差异有统计学意义(P0.01)。层粘连蛋白(LN):A组和B组治疗前后比较差异有统计学意义(P0.01)。C组治疗前后比较差异有统计学意义(P0.05)。A组与B组治疗后差异无统计学意义(P0.05)。A组和B组治疗后与C组治疗后比较差异有统计学意义(P0.01)。1.4三组患者Child-Pugh评分比较:三组治疗前后差异有统计学意义(P0.01)。A组和C组治疗后比较差异有统计学意义(P0.01)。B组和C组治疗后比较差异无统计学意义(P0.05)。1.5三组患者彩超指标比较:各组门脉内径治疗前后差异无统计学意义(P0.05)。脾脏厚度:A组和B组治疗前后差异有统计学意义,(P0.01)。三组治疗后下降幅度依次为:A组B组C组,并且差异有统计学意义(P0.01)。1.6 A组各中医证型综合疗效比较:五个中医证型总有效率依次为:痰瘀互结证痰湿内阻证肝郁气滞证肝郁脾虚证湿热蕴结证,各组总有效率比较差异有统计学意义(P0.01)。1.7 A组各中医证型证候积分比较:五组证候积分治疗前后差异有统计学意义(P0.01),治疗后差异无统计学意义(P0.05)。2.实验一生化指标检测结果显示,与MOL组比较,各治疗组大鼠肝功能(ALT、AST和GGT)及血脂水平(CHOL和TG)均显著降低(P0.01),尤其是H-KXRG组变化最显著。ELISA检测结果显示,与MOL组比较,各治疗组大鼠血清中纤维化相关蛋白均显著降低(P0.01),促炎因子TNF-α水平显著降低(P0.01),抑炎因子IL-10水平显著升高(P0.01),尤其是H-KXRG组变化最为显著。HE染色结果显示,与MOL组比较,FZHY和COL治疗组大鼠肝小叶结构受损轻,可见肝细胞炎性细胞浸润,胶原纤维增生减轻;不同浓度的KXRG治疗组大鼠肝小叶结构基本正常,肝细胞排列尚整齐,中央静脉周围可见部分肝细胞变性,病变区域面积较小,且肝细胞变性程度轻,纤维组织异常增生不明显,其中尤以H-KXRG治疗组大鼠肝组织病理变化缓解最显著。Masson染色结果显示,与MOL组比较,各治疗组大鼠肝脏中胶原纤维组织增生呈不同程度的减少,纤维化程度有明显好转,部分较细的蓝色纤维走行于血管周围,其中尤以H-KXRG治疗组大鼠肝组织纤维增生缓解最显著。TUNEL染色结果显示,与MOL组比较,在各治疗组中大鼠肝脏中棕褐色的凋亡细胞显著减少,凋亡率呈现不同程度的下降(P0.01);尤其是H-KXRG组肝细胞凋亡率降低的最为显著。Western blotting检测结果显示,与MOL组相比,Caspase-3、8、9的蛋白水平在各治疗组中均有不同程度的下降(P0.01)。其中在H-KXRG组中,Caspase-3、8、9的蛋白表达量下降幅度最大。促凋亡蛋白-Bax的表达水平变化趋势与Caspase家族(Caspase 3、8、9)相似,但抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-XL)和Bax的变化趋势则呈现相反的方向。3.实验二ELISA检测结果显示,与MOL组比较,KXRG治疗组TNF-α、IL-6水平显着降低(P0.01)。HE染色结果显示,与MOL组比较,KXRG治疗组大鼠肝小叶结构基本正常,肝细胞排列尚整齐,中央静脉周围可见部分肝细胞变性,病变区域面积较小,且肝细胞变性程度轻,纤维组织异常增生不明显。Western blotting结果显示,一方面,TGF-β信号通路相关蛋白中,与MOL组比较,KXRG治疗组TGF-β1、TGF-β2、Smad2和Smad3的表达水平显著降低(P0.01),而Smad7蛋白表达水平显著升高(P0.01);另一方面,TLR4信号通路相关蛋白中,与MOL组比较,KXRG治疗组中TLR4、My D88和NF-κB p65蛋白表达水平显著降低(P0.01)。研究结论1.抗纤软肝方联合熊去氧胆酸治疗非酒精性脂肪肝肝纤维化比熊去氧胆酸单药疗效好,可以改善肝功能、脾脏肿大状况、降低Child-Pugh评分,降低中医证候积分、抗纤维化作用强,安全性高。2.对比安络化纤丸联合熊去氧胆酸,在抗纤维化作用、改善Child-Pugh评分和继发性脾脏肿大方面更具优势。3.在不同中医证型中,痰瘀互结证疗效最佳。4.抗纤软肝方能显著改善NAFLD肝纤维大鼠的肝功能、血脂水平、肝脏病理学变化、肝细胞凋亡情况,且作用效果比对照药物(扶正化瘀及秋水仙碱)更加显著。5.抗纤软肝方能显著改善NAFLD肝纤维大鼠血清中TNF-α、IL-6分泌水平。6.抗纤软肝方可能是通过调控Caspases家族及Bcl-2家族相关蛋白的表达发挥对NAFLD肝纤维化大鼠肝脏中肝细胞凋亡的抑制作用。7.抗纤软肝方可能是通过调控TGF-β信号通路及TLR4信号通路防治NAFLD大鼠肝纤维化。创新性及科学意义首次通过临床研究和实验相结合的方法,初步明确抗纤软肝方治疗NAFLD肝纤维化疗效以及其作用机制。为临床应用提供理论基础。
【图文】：

示意图,灌胃,示意图,提取物

图 1 动物造模及药物处理示意图注：Control group:对照组（以 2 mL/100g/d 生理盐水灌胃）；Model group:模型组mL/100g/d 生理盐水灌胃）；FZHY group:扶正化瘀组（以 15 g/kg/d 扶正化瘀胶囊提胃）；Colchicine group:秋水仙碱组（以 0.1 mg/kg/d 秋水仙碱提取物灌胃）；KXRG 抗纤软肝方组；N-KXRG group:正常剂量抗纤软肝方组（以 9.2 g/kg/d 抗纤软肝提取物M-KXRG group:中剂量抗纤软肝方组（以 18.4 g/kg/d 抗纤软肝提取物灌胃）；H-KXRG 高剂量抗纤软肝方组（以 36.8g/kg/d 抗纤软肝提取物灌胃）。2.2 大鼠血清生化指标检测8 周后，禁食 12 h 的各组大鼠均行 60mg/kg 的戊巴比妥溶腔注射麻醉，从大鼠的腹主动脉采集血液样本，室温自然凝固 304℃，1000r/min，离心 15min，分离血清，收集上清，将上清液

水平变化,秋水仙碱,肝纤维化,ELISA检测

图 2 各组大鼠血清生化指标检测注：A：ALT 水平变化；B：AST 水平变化；C：GGT 水平变化；D：CHOL 水平变化；E：TG 水平变化。CTRL：对照组；MOL：模型组；FZHY：扶正化瘀治疗组；COL 秋水仙碱治疗组；N-KXRG：正常剂量抗纤软肝方治疗组；M-KXRG：中剂量抗纤软肝方治疗组；H-KXRG：高剂量抗纤软肝方治疗组。数据采用均值±标准差（X±SD）的形式表示（n=8）。与 CTRL 组比较，bP＜0.01；与 MOL 比较，dP＜0.01；与 FZHY 组比较，fP＜0.01；与 COL 组比较，hP＜0.01；与 N-KXRG组比较，jP＜0.01；与 M-KXRG 组比较，lP＜0.01。3.2 各组大鼠血清 ELISA 检测通过血清 ELISA 检测，评估肝纤维化及炎症反应的水平。ELISA检测结果显示，，一方面，如图 3A-2D 所示，与 CTRL 组比较，MOL 组
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.2

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