SCD1通过AMPK通路调节脂质自噬在NAFLD中的作用及机制探讨

发布时间：2020-03-23 03:25

【摘要】：背景和目的:非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指以肝细胞内脂质过度沉积,且既往无过量饮酒史以及其他明确的损肝因素为特征的临床病理综合征。NAFLD现在被认为是全球慢性肝病最常见的原因,肝内脂质异常聚集是其发生发展的基础。因此探索如何阻止脂质在肝细胞内异常沉积,对寻求NAFLD新的防治途径具有重要意义。硬脂酰辅酶A去饱和酶(Stearoyl-Co A desaturase 1,SCD1)参与高脂诱导下肝细胞脂肪变性,目前相关机制研究主要涉及调控肝细胞甘油三酯(Triglycerides,TG)合成及脂肪酸氧化。脂质自噬被认为是调节细胞脂代谢和脂质沉积的一种新机制,激活肝细胞内脂质自噬,可使肝细胞免受脂质沉积的损伤,在NAFLD中具有保护性效应。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信号通路参与自噬的调控,同时又受SCD1水平的影响。前期研究发现,抑制SCD1可激活AMPK信号通路,从而增强自噬促进肝癌细胞凋亡。然而,尚不清楚SCD1是否通过AMPK调节脂质自噬参与NAFLD的发生发展。鉴于此,本课题首先建立棕榈酸(palmitic acid,PA)诱导的小鼠原代肝细胞脂肪变模型,观察细胞模型中SCD1与AMPK、脂质自噬表达水平的关系,然后观察改变SCD1表达水平对小鼠原代肝细胞的脂质沉积、AMPK及脂质自噬的影响,再通过同时增强或抑制SCD1的表达及AMPK活性,探讨SCD1是否通过AMPK调控脂质自噬,影响小鼠原代肝细胞的脂质沉积;在此基础上,观察抑制体内SCD1表达水平对小鼠肝脏脂肪变性、AMPK以及脂质自噬的影响。本研究结果提示SCD1-AMPK-脂质自噬通路可作为NAFLD的潜在治疗靶点。方法:一、脂肪肝细胞模型中SCD1与AMPK、脂质自噬表达水平的关系1.CCK8法筛选PA刺激小鼠原代肝细胞的最适浓度。2.PA刺激小鼠原代肝细胞24h后,用TG酶法测定试剂盒检测TG含量,油红O染色检测肝细胞内的脂滴沉积情况。3.PA刺激小鼠原代肝细胞24h后,用Western-blot检测SCD1、AMPK、自噬相关蛋白LC3和p62的表达。二、改变SCD1表达水平对小鼠原代肝细胞的脂质沉积、AMPK及脂质自噬的影响1.si RNA-SCD1转染小鼠原代肝细胞48h后,用Western-blot检测SCD1蛋白表达水平,筛选及验证si RNA-SCD1的沉默效果。2.si RNA-SCD1转染小鼠原代肝细胞48h后,再用PA刺激肝细胞24h。原代肝细胞分为4组:对照组,si RNA-SCD1组,PA刺激组,PA+si RNA-SCD1组。用TG酶法测定试剂盒检测TG含量,油红O染色检测肝细胞内的脂滴沉积情况。3.用Western-blot检测上述各组原代肝细胞内的SCD1、AMPK、自噬相关蛋白LC3和p62的表达。4.SCD1过表达腺病毒(SCD1 overexpression adenoviruse,SCD1-OE)感染小鼠原代肝细胞48h后,用Western-blot检测SCD1蛋白表达水平,验证SCD1-OE的过表达效果。5.SCD1-OE感染小鼠原代肝细胞48h后,再用PA刺激肝细胞24h。原代肝细胞分为4组:对照组,SCD1-OE组,PA刺激组,PA+SCD1-OE组。用TG酶法测定试剂盒检测TG含量,油红O染色检测肝细胞内的脂滴沉积情况。6.用Western-blot检测上述各组原代肝细胞内的SCD1、AMPK、自噬相关蛋白LC3和p62的表达。三、SCD1通过AMPK调控脂质自噬,影响小鼠原代肝细胞的脂质沉积1.si RNA-SCD1转染小鼠原代肝细胞48h后,再用PA刺激细胞24h和AMPK抑制剂Dorsomophin刺激细胞2h。原代肝细胞分为8组:对照组,si RNA-SCD1组,Dorsomophin组,si RNA-SCD1+Dorsomophin组,PA刺激组,PA+si RNA-SCD1组,PA+Dorsomophin组,PA+si RNA-SCD1+Dorsomophin组。用TG酶法测定试剂盒检测TG含量,油红O染色检测肝细胞内的脂滴沉积情况。2.用Western-blot检测上述各组原代肝细胞内的SCD1、AMPK、自噬相关蛋白LC3和p62的表达。3.透射电镜观察上述各组原代肝细胞内自噬小体及自噬溶酶体的分布情况。4.SCD1-OE感染小鼠原代肝细胞48h后,再用PA刺激细胞24h和AMPK激动剂A-769662刺激细胞2h。原代肝细胞分为8组:对照组,SCD1-OE组,A-769662组,SCD1-OE+A-769662组,PA刺激组,PA+SCD1-OE组,PA+A-769662组,PA+si RNA-SCD1+A-769662组。用TG酶法测定试剂盒检测TG含量,油红O染色检测肝细胞内的脂滴沉积情况。5.用Western-blot检测上述各组原代肝细胞内的SCD1、AMPK、自噬相关蛋白LC3和p62的表达。6.透射电镜观察上述各组原代肝细胞内自噬小体及自噬溶酶体的分布情况。四、抑制体内SCD1表达水平对小鼠肝脏脂肪变性、AMPK以及脂质自噬的影响1.小鼠分为3组:正常饲料组(normal chow diet group,NCD),高脂饲料组(high fat diet group,HFD),CAY10566处理组(高脂饲料联合SCD1抑制剂CAY10566腹腔注射)。3组小鼠连续喂养14周,建模完成。全自动生化分析仪检测各组小鼠的肝功能及血脂水平。2.HE染色及油红O染色检测各组小鼠肝脏的脂肪变情况。3.Western-blot检测各组小鼠肝脏的SCD1、AMPK、自噬相关蛋白LC3和p62的表达。4.透射电镜观察小鼠肝脏组织内自噬小体及自噬溶酶体的分布情况。结果:一、脂肪肝细胞模型中SCD1与AMPK、脂质自噬表达水平的关系1.CCK8结果显示:324μM是PA刺激小鼠原代肝细胞的最适终浓度。2.TG测定及油红O结果均显示:与对照组相比,PA刺激原代肝细胞细胞后,TG含量及脂滴含量均明显升高(p0.05)。3.Western-blot结果显示:与对照组相比,PA刺激组SCD1蛋白表达量明显增高,p-AMPK/t-AMPK比值降低,自噬相关蛋白p62表达量增高,LC3-II/LC3-I的表达比例降低,(p0.05)。二、改变SCD1表达水平对小鼠原代肝细胞的脂质沉积、AMPK以及脂质自噬的影响1.Western-blot结果显示:si RNA-SCD1-414下调原代肝细胞SCD1蛋白表达的效果最明显,与空白对照组比较明显减少(p0.05)。2.TG测定及油红O结果均显示:抑制SCD1的表达后,原代肝细胞内的TG及脂滴含量明显减少。3.Western-blot结果显示:抑制SCD1的表达后,可激活原代肝细胞AMPK通路,同时自噬活性增加。4.Western-blot结果显示:SCD1-OE上调原代肝细胞SCD1蛋白表达的效果明显,与空白对照组比较明显增多(p0.05)。5.TG测定及油红O结果均显示:过表达SCD1后,原代肝细胞内的TG及脂滴含量明显增多。6.Western-blot结果显示:过表达SCD1后,可抑制原代肝细胞AMPK通路,同时自噬活性减弱。三、SCD1通过AMPK调控脂质自噬,影响小鼠原代肝细胞的脂质沉积1.TG测定及油红O结果均显示:与PA+Dorsomophin组比较,PA+si RNA-SCD1+Dorsomophin组肝细胞内的TG及脂滴含量明显降低;而与PA+si RNA-SCD1组比较,其含量反而增加(p0.05)。2.Western-blot结果显示:与PA组比较,PA+Dorsomophin组SCD1蛋白表达量无明显变化,AMPK活性降低,自噬活性降低。与PA+si RNA-SCD1组比较,PA+si RNA-SCD1+Dorsomophin组自噬活性降低;而与PA+Dorsomophin组比较,其活性反而增高(p0.05)。3.透射电镜结果显示:PA处理后,原代肝细胞内的自噬小体及自噬溶酶体数量减少;单独抑制SCD1表达后,自噬小体及自噬溶酶体数量增加。与单独抑制SCD1表达组比较,同时抑制SCD1表达及AMPK活性组,可使原代肝细胞内增加的自噬小体及自噬溶酶体数量减少。4.TG测定及油红O结果均显示:与PA+A-769662组比较,PA+SCD1-OE+A-769662组肝细胞内的TG及脂滴含量明显增加;与PA+SCD1-OE组比较,其含量反而降低(p0.05)。5.Western-blot结果显示:与PA组比较,PA+A-769662组SCD1蛋白表达量无明显变化,AMPK活性增加,自噬活性增加。与PA+SCD1-OE组比较,PA+SCD1-OE+A-769662组自噬活性增加;而与PA+A-769662组比较,其活性反而降低(p0.05)。6.透射电镜结果显示:单独增强SCD1表达后,原代肝细胞内的自噬小体及自噬溶酶体数量减少;单独增强AMPK活性后,自噬小体及自噬溶酶体数量增多。与单独增强SCD1表达组比较,同时增强SCD1表达及AMPK活性组,可使肝细胞内减少的自噬小体及自噬溶酶体数量增多。四、抑制体内SCD1表达水平对小鼠肝脏脂肪变性、AMPK以及脂质自噬的影响1.肝功及血脂检测结果显示:HFD组小鼠的肝功及血脂水平均明显高于NCD组,CAY10566组小鼠的肝功及血脂水平均明显低于HFD组(p0.05)。2.HE染色及油红O染色结果显示:HFD组小鼠肝脏组织脂肪变明显高于NCD组,CAY10566组小鼠肝脏组织脂肪变明显低于HFD组。3.Western-blot结果显示:与NCD组小鼠比较,HFD组小鼠肝脏组织中SCD1蛋白表达量明显增多,同时AMPK活性降低,自噬活性减弱。与HFD组小鼠比较,CAY10566组小鼠肝脏组织中SCD1蛋白表达量明显降低,同时AMPK活性增加,自噬活性增强。4.透射电镜结果显示:NCD组小鼠肝脏组织内有较多的自噬小体及自噬溶酶体分布;HFD组未观察到自噬小体及自噬溶酶体的分布;CAY10566组较NCD组自噬小体及自噬溶酶体减少,但与HFD组比较明显增多。结论:PA可诱导小鼠原代肝细胞脂质沉积,同时伴随SCD1表达增加,AMPK活性减弱,脂质自噬受抑。抑制SCD1表达,可增强AMPK活性,脂质自噬增强,肝细胞中脂质沉积减少;而过表达SCD1,可降低AMPK活性,脂质自噬减弱,肝细胞中脂质沉积增加。SCD1通过抑制AMPK,负性调控脂质自噬,从而影响肝细胞的脂质沉积。抑制体内SCD1的表达可减轻由高脂饮食诱导的小鼠肝脏脂肪变性,增强AMPK活性及脂质自噬。综上,SCD1-AMPK-脂质自噬通路可作为NAFLD的潜在治疗靶点。
【图文】：

小鼠,光镜,肝细胞,胞质

9) 数据分析：用 Bio-Rad 凝胶成像仪扫描蛋白条带光密度值，分析目的蛋白的相对表达含量。1.3 统计学分析数据以均数±标准差（x ±s）表示，并采用 SPSS17.0 软件进行处理。采用单因素方差分析，以 P<0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 小鼠原代肝细胞分离及鉴定如图 2.1 所示，光镜下观察小鼠原代肝细胞贴壁充分，核大而圆，可见肝细胞典型的双核结构，胞质扁平，展开形成特征的肝岛样结构。经糖原染色后，可见胞质内出现大量紫红色的糖原颗粒。肝细胞特征性抗原 CK-18 免疫荧光染色鉴定，可进一步证实所分离的细胞为小鼠原代肝细胞，且肝细胞纯度可达 95%以上。

最适浓度,小鼠,浓度,学位论文

重庆医科大学博士研究生学位论文鼠原代肝细胞的最适浓度显示：使用不用浓度 PA（0、108、180、252、324细胞 24h 后，与对照组比较，当 PA 浓度超过 32P<0.05）。为了降低 PA 对原代肝细胞的毒性作用，浓度，用于后续实验。见图表 2.2。表 2.2 PA 刺激小鼠原代肝细胞的最适浓度able 2.1 The optimal PA concentration for primary hepatoc 108 180 252 324 396 00 98.24 95.73 90.29 85.93*73.26* 1.96 2.49 4.25 3.27 3.18 0μM in primary hepatocyte)
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.5

【参考文献】