小窝蛋白-1在黄曲霉毒素B1致肝损伤中的作用与机制研究

发布时间：2020-03-23 09:35

【摘要】：研究背景与目的黄曲霉毒素(aflatoxins,AFTs)是食物和食品中最常见的真菌代谢产物,属于二氢呋喃香豆素的衍生物,被国际癌症研究机构归为I类致癌物。在黄曲霉毒素的几个亚型中,黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)毒性最大,在人体和动物体内也最为常见,肝脏是其主要的靶器官。AFB1进入体内后要发挥活性,首先必须通过细胞色素P450(Cytochrome P450)酶系统的转化,生成高度活性的中间产物AFB1-8,9-环氧化合物(AFB1-8,9-epoxide,AFBO),AFBO则能够与DNA、RNA、蛋白质等大分子结合,进而阻断基因的转录与翻译,影响基因表达。在这一过程中,AFBO代谢会大量消耗谷胱甘肽(glutathione,GSH),造成细胞内活性氧累积,产生脂质过氧化反应,引发DNA和蛋白损伤,诱导基因突变或细胞凋亡。可见在AFB1代谢过程中所引发的氧化应激是其致肝细胞损伤的直接原因。目前临床上治疗AFB1中毒也主要是采用体外补充抗氧化剂的方法。然而,目前关于AFB1引起氧化应激的机制及其中发挥作用的关键分子尚不清楚。因此,探寻AFB1致肝细胞氧化应激作用中的关键分子有望为AFB1临床治疗提供新靶点。小窝蛋白-1(Caveolin-1,Cav-1)是Caveolin家族成员之一,位于细胞膜和内体膜,主要通过自身磷酸化作用参与胆固醇转运、大分子内吞等过程。Cav-1能够调节细胞内多条信号转导通路,如受体酪氨酸激酶、Src家族酪氨酸激酶(Src,Fyn等)、内皮型一氧化氮合酶及一些下游信号分子H-Ras、MEK、ERK、PI3K/AKT等。Cav-1既是一种抑癌蛋白,又是一种癌蛋白,这种双重作用依据细胞类型、癌症发展阶段的不同而不同,也是近年来研究的热点问题。Cav-1也被发现与各种应激有关,包括氧化应激、紫外照射、放射治疗,以及与应激相关信号有关。最新证据表明,Cav-1是一种氧化应激相关蛋白,氧化应激可以影响Cav-1的膜转运。在氧化应激条件下,Cav-1磷酸化与细胞凋亡和细胞附着密切相关,而Cav-1的双重作用在氧化应激中也有体现,如有研究发现磷酸化Cav-1蛋白表达增加具有抗凋亡作用,可促进氧化应激后细胞存活。也有研究发现Cav-1表达减少或缺失能够显著抑制肺组织中性粒细胞趋化、黏附和上皮细胞/内皮细胞凋亡,减轻弥漫性肺泡损伤、肺血管内皮屏障损伤及肺水肿程度。我们前期研究发现AFB1作用过程中能够引起肝细胞中Cav-1的表达升高以及Cav-1分子定位的改变,提示Cav-1可能参与了AFB1引发的肝毒性。在此基础上,我们一方面通过下调或过表达Cav-1分析其在AFB1引起的肝损伤中的作用,另一方面从对氧化应激的调控途径上分析其作用机制。一、Cav-1在AFB1引发的肝细胞毒性中的作用研究方法:采用人正常肝细胞(L-02),通过细胞增殖实验、流式细胞术、免疫荧光、免疫蛋白印迹等方法检测AFB1作用后引起的肝毒性情况;通过转染质粒或siRNA分别过表达或下调肝细胞中Cav-1分子的表达,检测过表达或下调Cav-1对于AFB1处理引起的肝损伤的影响。此外选取了肝癌细胞系Huh7和HepG2两种细胞,通过下调Cav-1的表达分析其对细胞活性和凋亡的影响,以分析Cav-1是否在不同的肝细胞中发挥相似的作用。实验结果:AFB1能够在肝细胞中发挥毒性作用,表现为细胞活力下降,细胞凋亡增加,细胞内氧化应激水平升高(活性氧水平和MDA含量增加)。进一步发现AFB1能够引起Cav-1的表达增加,并引起Cav-1分子的细胞定位明显改变。在此基础上,下调肝细胞中Cav-1的表达后检测AFB1引发的肝细胞毒性,发现肝细胞活力下降明显减轻,细胞凋亡显著减少,氧化应激水平明显降低,而过表达Cav-1后,与上述结果相反。在肝癌细胞系Huh7和HepG2两种细胞中重复上述实验,得到了相似的结果。结论:AFB1可通过诱发氧化应激造成肝细胞损伤,导致肝细胞凋亡。在这一过程中,肝细胞中Cav-1蛋白分子发挥着重要的作用,AFB1促进了Cav-1的表达,促进了氧化应激。下调Cav-1的表达能够抑制AFB1诱发的氧化应激,提升细胞活力,减少细胞凋亡,提示Cav-1可能是参与AFB1引发肝细胞氧化应激的关键分子。二、Cav-1在AFB1引发的肝细胞毒性中的作用机制实验方法:从抗氧化应激关键通路Keap1-Nrf2信号通路入手,首先通过Western Blot检测Cav-1下调或过表达后对Nrf2及下游抗氧化应激重要分子HO-1与NQO-1表达的影响。进而通过免疫共沉淀、荧光酶素等方法检测Cav-1与Nrf2之间的相互作用,以及Cav-1对于Keap1-Nrf2信号通路的影响。此外,通过Western Blot和免疫荧光等分析Cav-1对AFB1处理后肝细胞自噬水平的影响,进一步利用自噬激活剂和抑制剂明确其作用。利用Wesrern Blot探寻Cav-1调节自噬的作用通路。同时,用Huh7和HepG2两种细胞株分别验证Cav-1调节氧化应激和自噬的作用机制。实验结果:通过下调Cav-1的表达,能够促进AFB1刺激后肝细胞中抗氧化应激酶Nrf2的表达和转录,以及HO-1、NQO-1的表达,同时能够显著抑制ROS与MDA的水平;反之,过表达Cav-1则发挥相反的作用。进一步发现Cav-1可通过与Nrf2直接作用来调控AFB1引发的氧化应激水平。Cav-1表达升高后,一方面抑制了Nrf2的转录,另一方面免疫共沉淀显示其与Nrf2的相互作用显著增强,从而影响了Nrf2与Keap1的解离,最终导致细胞的抗氧化应激作用受到抑制;此外,测定自噬标志分子LC3,发现Cav-1下调显著促进了AFB1作用后肝细胞的自噬水平,荧光标记细胞内自噬体的形成也得到了相同结果。自噬激活剂能明显降低AFB1引发的细胞毒性,抑制细胞凋亡,而自噬抑制剂则促进了AFB1的细胞毒性作用,促进细胞凋亡,Cav-1可通过调节细胞自噬影响AFB1的肝细胞损伤作用。进一步分析Cav-1调节自噬作用的信号通路发现,Cav-1在AFB1作用下并未改变经典自噬标志分子Beclin1和ATG5的表达,提示其调节作用并非通过经典自噬调节通路。AFB1作用后促进了表皮生长因子受体EGFR的磷酸化,这一作用促进了EGFR下游PI3K以及自噬调节因子mTOR的磷酸化激活,从而抑制了自噬作用。应用EGFR的抑制剂阿法替尼后,可明显促进细胞自噬作用,提升细胞活力,进一步佐证了该结果。此外,在肝癌细胞系Huh7和HepG2细胞中得到了与L-02细胞相似的结果。讨论:AFB1作用促进了Cav-1与氧化应激反应中关键分子Nrf2的直接相互作用。Cav-1一方面通过调控Nrf2 mRNA水平,另一方面通过与Nrf2蛋白相互作用,抑制其与Keap1解离,抑制其发挥抗氧化应激的调节作用,促进了AFB1引发的肝细胞损伤。此外,Cav-1可通过激活EGFR-PI3K-mTOR信号通路来抑制细胞的自噬作用,促进AFB1引发的肝细胞损伤。小结:AFB1进入体内后主要在肝脏中进行代谢,通过与肝细胞中的酶系统或分子相互作用来解毒。AFB1在代谢过程中能够引发氧化应激反应,造成肝细胞损伤甚至凋亡。本课题发现Cav-1为参与AFB1引发肝细胞损伤的关键分子,AFB1作用促进了肝细胞中Cav-1分子的表达上调及亚细胞定位的改变。Cav-1在参与AFB1引发的肝细胞损伤中主要发挥了两项重要的调节作用:上调的Cav-1分子一方面通过与Nrf2直接作用以及抑制Nrf2分子表达,从而抑制细胞的抗氧化应激水平,促进细胞活力下降和凋亡;另一方面,Cav-1分子通过激活EGFR-PI3K-mTOR这一非经典的自噬调节通路,抑制细胞的自噬作用,从而促进毒素引发的细胞活力下降和细胞凋亡。本研究有助于进一步解释AFB1致肝脏损伤的作用机制,并挖掘出一个关键分子,这为进一步防治黄曲霉毒素损伤提供了新的药物治疗靶点。
【图文】：

细胞活力,情况,浓度,细胞

图 1.AFB1 作用下肝细胞活力图 A. 不同浓度的 AFB1 作用于 L-02 细胞 36h 后细胞活力情况，随着浓度从 5μM-16，细胞活力逐渐降低；图 B. 40μMAFB1 作用于 L-02 细胞不同时间点的细胞活力情况间的延迟（0h-72h），细胞活力逐渐降低，，作用时间从 24h 开始，细胞活力显著降低。（P<

肝细胞凋亡,情况,相关蛋白,水解酶

图 2A.AFB1 暴露后肝细胞凋亡情况与正常组相比，AFB1 作用 36h 后，肝细胞凋亡率明显增加。（P<0.001***）（2）Western Blot 检测凋亡相关蛋白。细胞凋亡的启动和发展过程中，半冬氨酸水解酶（Cysteine-requiring Aspartate Protease，Caspase）蛋白家族
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575

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