肠易激综合征患者抗HuD抗体阳性血清对神经细胞自噬的影响

发布时间：2020-03-23 15:07

【摘要】：背景与目的 肠易激综合征(IBS)是一种以腹痛伴有排便频率和/或粪便性状改变的功能性胃肠病,目前发病机制仍待阐明。研究发现IBS患者存在多层面免疫系统激活,尤其是部分IBS患者血清中存在多种抗神经元抗体(aNA),可引起针对肠神经系统(ENS)的免疫反应,导致ENS内神经元损伤。慢性假性肠梗阻(CIPO)患者aNA阳性血清能促使神经细胞自噬,而IBS患者抗肠神经元抗体(AENA)阳性血清能导致肠神经元凋亡。本研究目的:明确IBS患者抗HuD抗体阳性血清或商品化抗HuD抗体能否导致神经细胞自噬,并阐释其损伤机制,探究抗HuD抗体在IBS发病中的病理生理作用。材料与方法 采用符合罗马Ⅲ诊断标准的IBS患者和健康受试者血清,参考前期应用间接免疫荧光法检测AENA、HuProtTM芯片检测血清中差异性抗体的结果。分别选择IBS患者AENA阴性且差异性抗体阴性血清(AENA-/PRO-组)、AENA阳性且抗HuD抗体阴性血清(AENA+/HuD-组)、AENA阴性且抗HuD抗体阳性血清(AENA-/HuD+组)、商品化单克隆鼠抗人HuD抗体(anti-HuD组)、健康受试者血清(HCs组)孵育培养SH-Sy5Y细胞24小时,并用胎牛血清(FBS组)孵育作为阴性对照,用雷帕霉素(rapamycin组)诱导自噬作为阳性对照。倒置显微镜下观察细胞形态,CCK-8检测细胞活性,间接免疫荧光法(抗LC3-Ⅱ/抗PGP 9.5/DAPI染色)检测神经细胞自噬,western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、P62、p-mTOR、Beclin-1的表达;透射电镜观察细胞超微结构的改变,明确有无自噬体的形成。结果 倒置显微镜下见anti-HuD组细胞生长密度减小,胞体缩小,细胞形态不规则,突起减少,折光性减弱;FBS组、HCs组、AENA-/PRO-组、AENA+/HuD-组和AENA-/HuD+组细胞形态正常,生长良好。CCK-8检测细胞活性显示:anti-HuD组细胞活性显著低于FBS组、HCs组、AENA-/PRO-组、AENA+/HuD-组和AENA-/HuD+组(P0.05)。间接免疫荧光显示:除rapamycin组外,其余各组均未见胞浆内抗LC3-II抗体绿色荧光浓聚,提示无自噬体形成。Western blot检测自噬相关蛋白表达量,结果显示 FBS 组、HCs 组、AENA-/PRO-组、AENA+/HuD-组、AENA-/HuD+组和anti-HuD组间LC3-II蛋白表达量无显著差异(均P0.05),且均显著低于rapamycin 组(P0.05)。HCs 组、AENA-/PRO-组、AENA+/HuD-组和 AENA-/HuD+组P62蛋白表达量显著高于FBS组、anti-HuD组和rapamycin组(P0.05),rapamycin 组 P62 蛋白表达量低于 FBS 组(P0.05);AENA+/HuD-组、AENA-/HuD+组和anti-HuD组p-mTOR蛋白表达量显著高于FBS组(P0.05),AENA-/HuD+组和anti-HuD组p-mTOR蛋白表达量显著高于HCs组,而rapamycin组p-mTOR蛋白表达量较其余各组均显著减少(P0.05);AENA-/HuD+组、anti-HuD组和rapamycin组Beclin-1蛋白相对表达量显著高于FBS组(P0.05)。电镜观察见HCs组、AENA-/PRO-组、AENA+/HuD-组和AENA-/HuD+组神经细胞胞质疏松,形成空洞,且可见脂滴和糖原堆积;Anti-HuD组同样可见部分细胞存在胞质疏松、脂滴增多和糖原堆积现象,且可见死亡细胞;除rapamycin组外,其余各组内均未见自噬体形成。结论 商品化单克隆鼠抗人HuD抗体可显著引起SH-Sy5Y细胞损伤和死亡,该作用可能是通过抑制细胞自噬,激活细胞凋亡或坏死等其他途径实现的。IBS患者抗HuD抗体阳性血清可致SH-Sy5Y细胞损伤并影响自噬通路相关蛋白的表达。人血清,特别是IBS患者血清中的部分物质可影响SH-Sy5Y细胞的糖脂代谢过程,对细胞造成损伤。抗HuD抗体所致神经元损伤可能与部分IBS患者的发病相关。
【图文】：

免疫染色一抗稀释液逦Ｂｅｙｏｔｉｍｅ逡逑免疫荧光染色二抗稀释液逦Ｂｅｙｏｔｉｍｅ逡逑ＰＡＧＥ预制胶（１０％、１２％）逦Ｂｅｙｏｔｉｍｅ逡逑蛋白上样缓冲液（ｌｏａｄｉｎｇ邋ｂｕｆｆｅｒ，，５Ｘ）逦Ｂｅｙｏｔｉｍｅ逡逑蛋白酶碟酸酶抑制剂混合物（５０Ｘ）逦Ｂｅｙｏｔｉｍｅ逡逑ＲＩＰ媒解液逦Ｓｏｌａｒｂｉｏ逡逑ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒逦Ｓｏｌａｒｂｉｏ逡逑蛋白标准品（５．０ｍｇ／ｍｌ）逦Ａｐｐｌｙ邋ｇｅｎ逡逑蛋白预染ｍａｒｋｅｒ逦Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ逡逑脱脂奶粉逦ＢＤ邋Ｄｉｆｃｏ逡逑Ｗｅｓｔ邋ｅｍ一抗稀释液逦Ｂｅｙｏｔｉｍｅ逡逑Ｓｕｐｅｒｓ邋ｉｇｎａｌ邋ｗｅｓｔ邋ｆｅｍｔｏ最高灵敏度化学发光液逦Ｔｈｅｒｍｏ逡逑（３）免疫荧光染色所用抗体逡逑见表２。逡逑表２疫荧光染色所用抗体逦逡逑

ａｌｉａｎ邋ｔａｒｇｅｔ邋ｏｆ邋ｒａｐａｍｙｃｉｎ，邋ｍＴＯＲ）复合物邋１邋（ｍＴＯＲ邋ｃｏｍｐｌｅｘ邋１，ｍＴ常被认为是调控自噬的阀门，其起到负性调节作用。当ｍＴＯＲＣｌ活性被抑的哺乳动物ｕｎｃ－５１－样激酶１邋（ｕｎｃ－５１－ｌｉｋｅ邋ｋｉｎａｓｅ邋１，邋ＵＬＫ１）和Ａｇｔｌ３磷酸化，导致ＵＬＫ１激酶的活化并诱导自噬发生。其后下游的Ｂｅｃｌｉｎ－１酸化，并作为ＩＩＩ型枺脂酰肌醇３激酶（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ邋３－ｋｉｎ／Ｂｅｃｌｉｎ－１复合物的整体支架，促进胞浆内的ＬＣ３－Ｉ向ＬＣ３－ＩＩ转变，并膜上，进一步形成成熟的自噬体［３６：。Ｐ６２，亦称为ＳＱＳＴＭ１，是一个泛自噬发生时，胞质中的Ｐ６２—方面与泛素化的蛋白质连接，另一方面体膜上的ＬＣ３－ＩＩ蛋白相结合形成复合物，以协助胞浆内的受损细胞器被自噻体包裹，并共同在自噻溶酶体中降解。因此，当自噬发生时，Ｐ；而自噬／溶酶体降解途径被抑制时，Ｐ６２蛋白则不断累，证明其表达反比［３９：。因此应用蛋白质免疫印迹技术检测ＬＣ３－ＩＩ、Ｐ６２、ｐ－ｍＴＯＲ、Ｂｅｃｌ表达情况，可反映自噬水平的高低。逡逑Ｓｔｒｅｓｓ邋ｓｉｇｎａｌｓ邋／＾＾ＹａＴＧ１３Ｇｒｏｗｔｈ邋ｓｉｇｎａｌｓ逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R574.4

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本文编号：2596897