羟基喜树碱诱导大鼠肝星状细胞HSC-T6凋亡相关机制的研究

发布时间：2020-03-23 16:49

【摘要】：目的： 研究羟基喜树碱（hydroxycamptothecine,HCPT）对肝星状细胞线粒体凋亡相关蛋白凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor,AIF）及死亡受体途径相关蛋白FAS、FASL表达的影响，初步探讨HCPT诱导HSC-T6凋亡的作用机制。 方法： 采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液体外培养HSC-T6细胞，待肝星状细胞生长至对数生长期时用无糖DMEM培养使细胞同步化，将细胞分为两大组：①对照组：用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液培养细胞各1h,6h,12h及24h（分别用B1、B6、B12、B24表示）；②HCPT实验组：用浓度为0.5mg/LHCPT进行干预HSC-T6细胞,各培养1h,6h,12h及24h（分别用H1、H6、H12、H24表示），每组实验重复6次。干预时间完成后收集各组的细胞和细胞培养上清液进行以下指标的检测：①吖啶橙/溴化乙锭染色观察HSC-T6细胞的凋亡情况；②逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测AIF、Fas、FASL基因水平的表达；③Western blot印记法检测AIF、FAS、FASL蛋白水平的表达；④激光共聚焦显微镜观察AIF在细胞凋亡时胞内定位的变化。 结果： 1、吖啶橙/溴化乙锭双重染色：对照组细胞培养1h、6h、12h、及24h后染色均未见明显改变，细胞凋亡率均较低，各组之间比较无统计学意义（P值均0.05）；0.5mg/L HCPT作用于肝星状细胞株HSC-T61h、6h，未见明显的细胞凋亡情况，细胞凋亡率与各对照组比较无统计学意义（P值均0.05）；作用12h及24h后可见细胞发生形态学改变，如细胞体积缩小、皱缩、细胞核碎裂，较对照组及作用1h、6h后的细胞凋亡率明显升高（P值均0.05），且HCPT作用24h组细胞凋亡率高于HCPT作用12h组，差异有统计学意义（P 0.05）。 2、RT-PCR检测AIF、Fas、FASL的表达：各实验组AIF的表达量与正常组比较无统计学意义（P值均0.05），正常组及实验组均未见Fas及FASL表达。 3、Western blot印记法检测AIF、FAS、FASL的表达：各实验组AIF的表达量与正常组比较无统计学意义（P值均0.05），正常组及实验组均未见Fas及FASL表达。 4、激光共聚焦显微镜观察AIF的位移变化：对照组细胞的细胞浆呈红色，为AIF的正常定位染色，细胞核经DAPI染色呈亮蓝色荧光，核浆结构清晰；经HCPT作用1h及6h后，细胞浆仍呈红色，细胞核为蓝色，12h后发现细胞核内出现红染，但发生红染的细胞较少，24h后细胞核发生红染的细胞数显著增加，许多经DAPI染蓝色的细胞核出现红色斑点。 结论： HCPT可诱导肝星状细胞发生凋亡，其诱导细胞凋亡的程度可能与作用时间成正比；HCPT作用机制可能为凋亡诱导因子相关的线粒体凋亡途径，即HCPT促使AIF从线粒体发生位移至细胞核内，激活细胞核内的凋亡信号，，促进HSC-T6发生凋亡；同时本研究反映FAS/FASL可能未参与HCPT诱导HSC凋亡的过程。
【图文】：

A：DMEM 培养 1h；B：DMEM 培养 6h；C：DMEM 培养 12h；D：DMEM 培养 24h；E：HCPT 作用 1h 组；F：HCPT 作用 6h 组；G：HCPT 作用 12h 组；H：HCPT 作用 24h 组图 1 HCPT 处理前后吖啶橙/嗅化乙啶双重染色结果 ×40（2）如表2、图2所示对照组之间细胞的凋亡率差异不明显，无统计学意义（P值>0.05）；经HCPT作用1h、6h后细胞的凋亡率与各对照组间比较无统计学意义（P值>0.05）。经HCPT作用12h、24h后细胞的凋亡率与其他各组比较明显升高，差异有统计学意义（P值<0.05），经HCPT作用24h组较经HCPT作用12h组明显增高，差异有统计学意义（P值<0.05）。表 2 AO/EB 染色检测细胞的凋亡率分组 n 细胞凋亡率B1 6 3.89％±0.58％#B6 6 3.88％±0.57％★#B12 6 3.88％±0.58％★#B24 6 3.89％±0.57％★#H1 6 3.74％±0.67％★#H6 6 3.97％±0.52％★#H12 6 27.85％±0.98％▲#H24 6 50.64％±1.06％▲

HCPT 对肝星状细胞 AIF、FAS、FASL 表达的影响.1 AIF、FAS、FASL 基因的表达如图 3、图 4 所示各对照组间 AIF 的表达（正常培养 1h 组-A1：0.745±0培养 6h 组-A2：0.747±0.163，正常培养 12h 组-A3：0.742±0.147，正常 组-A4：0.745±0.105）差异不明显，无统计学意义（P 值>0.05）；经 1h、6h、12h、24hAIF 的 mRNA 表达（A5：0.747±0.163，A6：0.737±00.732±0.160，A8：0.730±0.141）与各对照组比较无统计学意义（P 值>0 HCPT 作用后的 4 个不同时间点之间 AIF 的表达（A5、A6、A7、A明显，没有统计学意义（P 值>0.05）（具体相对表达数值见表 3）。对验组均未见 FAS 及 FASL 表达。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R575.2

【参考文献】

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本文编号：2597001