云南省HCV主要基因型进化起源与嵌合体病毒构建初步研究

发布时间：2020-03-24 01:47

【摘要】：HCV是导致慢性肝炎的主要病原体之一,全球感染人数大约为1.7亿。丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)属单股正链RNA病毒、黄病毒科、肝炎病毒属,基因全长约9.6kb。由于病毒复制过程中,RNA依赖的RNA聚合酶缺乏校对功能,导致HCV基因组中核苷酸突变频率极高。核酸突变所致的HCV遗传多样性可以表现在不同水平,根据HCV的核苷酸序列的同源性,可将HCV分为6个基因型,和至少80多个基因亚型。HCV众多基因型、亚型的主要流行区域、主要传播途径及其起源、进化特点都存在着区别。如3型主要流行于亚洲、北美及欧洲部分地区；4型主要流行于中非、中东和欧洲地区；5型主要发现于非洲和欧洲部分国家；6型则主要在东南亚和北美地区流行。1、3、6型主要是通过静脉吸毒传播,辅助血液等原因；2型主要是通过奴隶交易的方式传播；4、5型主要是通过不洁针具和医疗事故等原因传播。我国流行的HCV有1、2、3和6四种基因型,其中北方仍以1b和2a型为主要流行基因型,3型和6型近年来在华南、西南地区快速传播。 利用现代病毒变异与进化分析方法,深入了解云南省HCV不同基因型差异性流行与进化特点,对阐明云南省HCV的分子流行病学特征,针对性制定丙型肝炎预防控制策略具有重要意义。鉴于此,我们选取云南地区分别采集自2005、2008和2010年每年各50例的HCV抗体阳性样本。通过基因序列同源关系发现,三年的样本共包含4种基因型(1/2/3/6)和9种基因亚型(1b/2a/3a/3b/6a/6m/6n/6v/6k),其中2005年完成基因测序的34例样本分型包括6种基因亚型,分别为1b(14,41.3%)、2a(6,17.6%)、3b(9,26.3%)、6n(2,5.9%)、6v(1,3.0%)、6k(2,5.9%)；2008年40例样本包括6种基因亚型,分别为1b(8,20.0%)、2a(9,22.5%)、3a(3,7.5%)、3b(18,45.0%)、6a(1,2.5%)、6n(1,2.5%)；2010年40例样本包括1b(13,32.5%)、3a(8,20.0%)、3b(16,40.0%)、6m(1,2.5%)、6n(2,5.0%)5种基因亚型。经统计分析发现,2005-2010年间云南地区主要以1b(共35例,30.7%)和3b(共43例,37.7%)为主要流行基因型,部分基因型分布在三年内有显著变化,其中3a亚型由2005年的0(0%)例增长到2010年的8(20.0%)例,2a却由2005年的6(17.6%)例减少到2010年的0(0%)例。进而,我们基于3b基因型内毒株的序列变异,使用BEAST软件计算其起源时间和进化速率,中国簇的起源时间为1949左右,其进化速率为0.55E-03,分通过与邻近地区参考株对比分析,发现云南流行的3b毒株直接传播源头为东南亚国家,更早的源头可能是巴基斯坦。另外,云南地区流行的3b型HCV还因人群的不同有很大差异,从同源关系上明显分为静脉吸毒人群和非吸毒人群两个簇,Bayesian skyline plot (BSP)分析发现,这两个人群之间HCV已发生交叉传播。 6u基因型自2003年在云南省静脉吸毒人群中开始发现,其流行呈逐年增多的趋势,为探讨6u型病毒快速流行的分子机制,需要构建6u/2a嵌合型病毒培养体系,以了解6u型病毒的增殖特点。我们首先扩增获得完整的Core-E1-E2-p7-NS2区基因区段(长约3100bp)。在此过程中,将目的片段分成四个片段(分别命名为片段1-4)分别进行扩增,长度分别为542bp、980bp、861bp、708bp,利用重叠模板PCR技术进行拼接,渐次获得更长基因区段。将获得长基因区段经双酶切(AgeI和SpeI)后,插入已有的J6/JFH1质粒中,构建重组质粒。以线性化的重组质粒模板,体外转录获得重组病毒全长RNA,经提取纯化后转染Huh7.5.1细胞。对培养细胞上清及细胞内HCV核酸进行定性、定量进行检测,发现病毒RNA可在细胞中复制和表达,测得胞内外病毒载量均为105左右,初步确认病毒已进行有效增殖。 本研究对云南省HCV基因型流行分布,进行了跨年度系统研究,总结了2005-2010年云南省HCV基因型的流行分布特征,分析了云南省3b型的起源进化关系,并推测出云南省HCV基因型未来的分布特点。此外,本研究结合了本省首次发现的6u型毒株,构建了嵌合体病毒6u/JFH1,并进行了初步分析。为未来云南省做好HCV的预防控制策略提供了研究依据,为HCV致病机制及疫苗研制等方面的研究提供技术平台。
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R512.62

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本文编号：2597607