重组表达幽门螺杆菌致病岛CagL蛋白及其抗体阻断粘附试验

发布时间：2020-03-24 02:51

【摘要】： 幽门螺杆菌(H.pylori.Hp)在全球的感染率超过50%,它是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要致病因子,还与肠型胃癌和胃黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤的发生密切相关。H.pylori侵入机体后能够产生损伤胃粘膜的毒素,并诱发机体一系列炎症、免疫反应,这与其在胃粘膜定植生存有关。致病的H.pylori菌株含有一个约40kb的特殊基因片段,即cag致病岛(cytotoxin associated gene pathogenicity island,cag PAI),该基因序列呈高密度分布并编码一个分泌转运系统称为Ⅳ型分泌系统(type IV secretion system,TFSS)。在H.pylori粘附定植的过程中,H.pylori致病因子是通过Ⅳ型分泌系统转运进入宿主细胞的,在转运过程中CagL蛋白的参与非常重要。它通过H.pylori菌毛与宿主接触,导致黏着斑激酶(FAK)和Src家族激酶(Src familykinases, SFKs)的活化及酪氨酸磷酸化,诱导肌动蛋白细胞骨架重新排列,细胞浆膜的动态变化,整合素的聚集及其它受体的活化;同时活化的Src刺激下游信号系统,导致宿主细胞诱导促炎症反应细胞因子如IL-8的合成和分泌。CagL的这些生物学行为对H.pylori致病因子进入宿主的细胞和引发宿主细胞病理改变极为重要。因此,本研究拟对CagL基因进行克隆表达,制备多克隆抗体进行阻断粘附试验,这将有助于进一步明确CagL在H.pylori致病性及定植机制中的作用,并为研制H.pylori疫苗奠定基础。方法和结果: 1.重组幽门螺杆菌CagL蛋白的表达、纯化采用PCR方法以H.pylori(NCTC 11639株)基因组DNA为模板,扩增cagL基因片段并构建在原核表达载体PET-22b(+)中,通过酶切、测序鉴定阳性重组子。将含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)中,酶切鉴定和基因测序结果显示,幽门螺杆菌cagL基因被正确克隆到PET-22b(+)中。应用生物信息学软件DNAssist和GenBank数据库对已公布的H.pylori基因序列进行相似性分析。克隆cagL基因的核苷酸序列长度为714bp,与GenBank中(11639)序列比较,基因相似性为100%。经IPTG诱导,经SDS-PAGE分析,目的蛋白表达率约为40%,超声破菌后电泳鉴定目的蛋白以包涵体形式表达。用?KTA-explore纯化系统纯化出CagL。用SDS-PAGE对纯化产物分析表明CagL的纯度90%。Western blot结果显示重组幽门螺杆菌CagL蛋白具有与抗H.pylori多克隆抗体血清的免疫反应性; 2制备兔抗CagL多克隆抗体血清及其鉴定以纯化蛋白为抗原加弗氏佐剂免疫家兔,制备兔抗CagL多克隆抗体血清,双扩试验和ELISA试验鉴定其免疫性。ELISA检测出多克隆血清的效价为1:16,000。经双向免疫扩散检测,多克隆血清效价为1:16。 3兔抗CagL多克隆抗体血清对幽门螺杆菌粘附阻断实验: 3.1 CagL多克隆抗体血清对幽门螺杆菌粘附阻断实验将幽门螺杆菌接种于H.pylori选择培养基中,在5% O_2,85% N_2,10% CO_2,37℃条件下培养,24h后挑菌进行形态及生化鉴定。将H.pylori培养至对数生长期(OD600nm=0.6)。再将H.pylori和CagL多克隆抗体中和后加入贴壁生长在盖玻片上的Hela细胞中,37℃、5%CO_2共同孵育4h,分别加入H.pylori和DH5α菌作为阳性对照及阴性对照。姬姆萨染色结果显示CagL多克隆抗体有阻断幽门螺杆菌粘附定植Hela细胞能力。 3.2酶联免疫吸附测定分析IL-8浓度用3.1的操作方法,取细胞上清液,用酶联免疫吸附测定分析IL-8浓度。结果显示:CagL多克隆抗体血清预先中和的H.pylori和未中和的H.pylori对照间有显著性差异(p0.05),前者IL-8水平显著低于后者。表明CagL多克隆抗体血清与H.pylori抗原充分结合后,可以减少H.pylori促进细胞分泌IL-8的能力。结论: 本研究成功构建、表达、纯化出的重组幽门螺杆菌CagL蛋白,具有良好的免疫原性和免疫反应性。阻断粘附实验说明制备的CagL多克隆抗体血清对阻断H.pylori的粘附能力发挥了重要的作用。细胞因子IL-8的检测表明CagL多克隆抗体血清可以减少H.pylori促进细胞分泌IL-8的能力。以上实验说明CagL蛋白在H.pylori定植并转化CagA进入细胞和诱导细胞表达IL-8方面具有重要的作用。本研究为H.pylori致病性及定植机制研究奠定了基础,并为进一步探索其在H.pylori疫苗研制中的潜在作用提供了实验依据。
【图文】：

琼脂糖电泳

PCR扩增得到cagL基因片段，，大小约为714bp(见图1-1)，片段大小与预期相符。1:DNA marker2:PCR product of cagL (714bp)图 1-1 琼脂糖电泳检测 PCR 扩增产物Fig1-1 Analysis of PCR product by agarose gel electrophoresis二、重组质粒pMD-18T-CagL酶切鉴定将扩增片段回收纯化后与pMD18-T载体连接转化受体菌DH5α经氨苄青霉素筛选，增菌后抽提质粒，经XhoⅠ和NdeⅠ双酶切后电泳检测，在约714bp处可见到酶切片段，如图1-2所示。26

重组蛋白,摇瓶

图 1-4 SDS-PAGE 检测重组蛋白 PET22b(+)-CagL 表达(摇瓶)Fig 1-4 The expression of induced CagL by SDS-PAGEe of PET-22b(+)/BL21 before IPTG induction；2：lysate of PET-22induced with IPTG for 4h; 3：protein molecular weight marker2b(+)-CagL recombinant strain induced with IPTG for 0h、1h、2h、4h
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R573

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