NCX1在急性胰腺炎发生发展过程中的作用及机制研究
发布时间：2020-03-25 16:14
【摘要】：目的:观察雨蛙素刺激对胰腺外分泌细胞增殖、自噬的影响,探讨Sp1/NCX1/Ca~(2+)超载通路和NF-κB/NCX1/Ca~(2+)超载通路在急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)中的作用及其机制。方法:通过雨蛙素注射大鼠腹腔构建AP模型,用生化分析仪测定大鼠血清中淀粉酶和脂肪酶活性;雨蛙素刺激胰腺腺泡细胞AR42J,体外诱导细胞AP模型,采用CCK-8检测雨蛙素处理后不同时间(0、24、48、72 h)的细胞增殖情况。Western blot检测自噬的经典标记物LC3Ⅰ和LC3Ⅱ在雨蛙素处理后不同时间(0、3、6、12、24h)的表达变化以及Sp1、NF-κB和NCX1在雨蛙素处理后不同时间(0、1、3、6、12、24 h)蛋白水平的变化。Western blot检测Sp1抑制剂Mithramycin A和NF-κB抑制剂Bay分别处理AR42J细胞后检测NCX1蛋白水平变化。双荧光素酶报告系统检测Sp1和NF-κB对NCX1的转录调控。通过激光共聚焦显微镜观察AR42J细胞中胞浆Ca~(2+)的变化。结果:在大鼠AP模型中,雨蛙素可上调血清淀粉酶和脂肪酶的活性(P0.05),促进NCX1蛋白水平的表达。免疫组化结果显示雨蛙素腹腔注射可诱导胰腺组织中NCX1、Sp1和NF-κB蛋白表达。在细胞AP模型中,雨蛙素可抑制AR42J细胞的增殖(P0.05),且使LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加,还可上调AR42J细胞中NCX1、Sp1和NF-κB蛋白表达。用Sp1抑制剂M.A或NF-κB抑制剂Bay处理AR42J细胞均抑制了NCX1蛋白的表达。双荧光素酶实验结果显示M.A和Bay均可明显抑制含有NCX1启动子序列的双荧光素酶载体的活性(P0.05)。激光共聚焦显微镜观察发现雨蛙素刺激可使AR42J细胞内Ca~(2+)增加(P0.05)。结论:Sp1和NF-κB上调NCX1的表达在雨蛙素诱导的急性胰腺炎中发挥促进作用,并为AP治疗提供了潜在的靶点。
【图文】：
图 1：雨蛙素刺激在体内和体外诱导 AP 模型。A：血清脂肪酶活性（*P<0.05, n=5）; B：血清淀粉酶活性（***p＜0.001, n=5）; C：CCK8 检测雨蛙素处理后在不同时间点（0h, 24h, 48hand 72h）AR42J 细胞的增殖情况; D：Western blot 检测雨蛙素刺激 AR42J 细胞后在不同时间点（0h, 3h, 6h, 12h and 24h）自噬水平。*p＜ 0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001, ****p < 0.0001，n=3。Fig1: AP model was induced by caerulein in vivo or in vitro. A and B: Concentrations ofserum lipase and amylase were measured by a biochemical analyzer; C: CCK8 detection of cellproliferation was adopted at 0h, 24h, 48h and 72h after treatment with caerulein. D: LC3II/LC3I, autophagy classic markers, were detected by Western blot at different time points of 0h,3h, 6h, 12h, 24h.. *p＜ 0.05, ***p＜0.001, ****p < 0.0001，n=3.2.2 雨蛙素诱导的 AP 模型中 NCX1 表达上调。为了研究NCX1在AP模型中的表达及可能的功能，我们首先通过Western blot检测大鼠 AP 模型中 NCX1 蛋白的表达情况，结果表示，和阴性对照组比较，，大鼠
图 2：NCX1 在雨蛙素诱导的 AP 模型中上调。A：雨蛙素诱导大鼠 AP 模型，Western Blot检测与对照组比较，NCX1 的表达变化情况（*P<0.05, n=4）。B：免疫组织化学染色方法检测大鼠 AP 模型中对照组和雨蛙素组胰腺组织中 NCX1 的表达情况。C：雨蛙素诱导细胞 AP模型，Western Blot 检测不同时间点（0，1，3，6，12 and 24 h）NCX1 的表达变化情况（*P<0.05,n=3）。在雨蛙素构建的大鼠和细胞 AP 模型中，NCX1 的表达均明显上调。Fig 2: NCX1 was upregulated in cerulein-induced AP models.A: Western blot was used todetect the expression of NCX1 in ratAP model induced by cerulein(*P<0.05, n=4). B: NCX1protein was measured by immunohistochemical staining. C: NCX1 was detected by Westernblot and PCR in cellAP model at different time points of 0, 1h, 3h, 6h, 12h, 24h（*P<0.05, n=3）.2.3 NCX1 上调介导钙超载为了验证 AR42J 细胞对雨蛙素处理是否引起[Ca2+]cyt升高，并且 NCX1 是否参与了该过程，我们设计了钙测定实验。在细胞外 0Na+的环境下，由于细胞内外浓
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R576
本文编号：2600115
【图文】：
图 1：雨蛙素刺激在体内和体外诱导 AP 模型。A：血清脂肪酶活性（*P<0.05, n=5）; B：血清淀粉酶活性（***p＜0.001, n=5）; C：CCK8 检测雨蛙素处理后在不同时间点（0h, 24h, 48hand 72h）AR42J 细胞的增殖情况; D：Western blot 检测雨蛙素刺激 AR42J 细胞后在不同时间点（0h, 3h, 6h, 12h and 24h）自噬水平。*p＜ 0.05, **p＜0.01, ***p＜0.001, ****p < 0.0001，n=3。Fig1: AP model was induced by caerulein in vivo or in vitro. A and B: Concentrations ofserum lipase and amylase were measured by a biochemical analyzer; C: CCK8 detection of cellproliferation was adopted at 0h, 24h, 48h and 72h after treatment with caerulein. D: LC3II/LC3I, autophagy classic markers, were detected by Western blot at different time points of 0h,3h, 6h, 12h, 24h.. *p＜ 0.05, ***p＜0.001, ****p < 0.0001，n=3.2.2 雨蛙素诱导的 AP 模型中 NCX1 表达上调。为了研究NCX1在AP模型中的表达及可能的功能，我们首先通过Western blot检测大鼠 AP 模型中 NCX1 蛋白的表达情况，结果表示，和阴性对照组比较，，大鼠
图 2：NCX1 在雨蛙素诱导的 AP 模型中上调。A：雨蛙素诱导大鼠 AP 模型，Western Blot检测与对照组比较，NCX1 的表达变化情况（*P<0.05, n=4）。B：免疫组织化学染色方法检测大鼠 AP 模型中对照组和雨蛙素组胰腺组织中 NCX1 的表达情况。C：雨蛙素诱导细胞 AP模型，Western Blot 检测不同时间点（0，1，3，6，12 and 24 h）NCX1 的表达变化情况（*P<0.05,n=3）。在雨蛙素构建的大鼠和细胞 AP 模型中，NCX1 的表达均明显上调。Fig 2: NCX1 was upregulated in cerulein-induced AP models.A: Western blot was used todetect the expression of NCX1 in ratAP model induced by cerulein(*P<0.05, n=4). B: NCX1protein was measured by immunohistochemical staining. C: NCX1 was detected by Westernblot and PCR in cellAP model at different time points of 0, 1h, 3h, 6h, 12h, 24h（*P<0.05, n=3）.2.3 NCX1 上调介导钙超载为了验证 AR42J 细胞对雨蛙素处理是否引起[Ca2+]cyt升高，并且 NCX1 是否参与了该过程，我们设计了钙测定实验。在细胞外 0Na+的环境下，由于细胞内外浓
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R576
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 杨淑丽;刘洁;陈卫昌;;自噬在急性胰腺炎发生发展中的作用[J];临床肝胆病杂志;2014年08期
本文编号：2600115
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