肝纤维化相关细胞因子shRNA表达载体的构建及在肝星状细胞中的表达

发布时间：2020-03-26 14:47

【摘要】： 目的：结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)是新近发现的一种促肝纤维化的重要细胞因子,是转化生长因子β(transforming growth factorβ, TGF-β)信号传导途径的下游效应介质。CTGF可直接介导原代肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)活化、增殖及迁移,还能促进活化HSC的合成及分泌细胞外基质(extracellular matrix, ECM)。金属蛋白酶组织抑制因子1 (tissue inhibitor of metalloproteinase 1, TIMP-1)也是TGF-β信号传导途径的下游效应介质,在肝纤维化发生时,它主要由激活的HSC表达。TIMP-1不仅抑制基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)活性阻止胶原降解,也通过抑制HSC凋亡、促进胶原分泌而在肝纤维化病情进展中发挥关键作用。所以,减少CTGF和TIMP-1的表达,可以减轻肝纤维化程度。本研究旨在构建以大鼠CTGF或TIMP-1基因为靶点的短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)表达载体,为进一步探索肝纤维化的基因治疗提供有力工具。方法：根据前期筛选出的对CTGF和TIMP-1基因最有效的RNA干扰靶位,即CTGF基因1560～1580nt和TIMP-1基因412～432nt,按照RNA干扰(RNA interference, RNAi)序列设计原则,各设计1对含有短发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,分别克隆到经双酶切后的质粒载体psiRNA-DUO-GFPzeo,构建成含目的靶基因片段的重组质粒载体psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com(含有CTGF和TIMP-1),并对重组质粒进行双酶切琼脂糖电泳和测序鉴定。体外复苏培养大鼠的肝星状细胞,取对数生长期细胞0.25%胰蛋白酶消化,3×105／ml接种于六孔板中,待细胞长到80%左右融合时,无血清Opti-MEM培养基培养同步化,利用脂质体(TransFast Transfmlection Reagent) 2000介导,将构建成功的重组质粒(psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com(含有CTGF和TIMP-1)及空载体psiRNA-DUO-GFPzeo瞬时转染大鼠的肝星状细胞,荧光显微镜观察质粒转染情况,用流式细胞仪测转染的效率。结果：1、证实以大鼠CTGF或TIMP-1基因为靶点的表达shRNA的目的基因片段分别被成功的克隆到质粒载体psiRNA-DUO-GFPzeo中,测序结果证明重组质粒载体的插入序列与设计的靶基因片段完全一致。2：用瞬时转染肝星状细胞后荧光显微镜观察,在转染进质粒的细胞全部发绿色荧光,初步证实能转染进肝星状细胞。结论：成功构建靶向大鼠CTGF和TIMP-1最有效的RNA干扰靶位的shRNA表达质粒重组体。瞬时转染到转染大鼠的肝星状细胞,在荧光显微镜能发现带有荧光的细胞,说明成功转染进肝星状细胞。这样为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径打下了实验基础。
【图文】：

图1.质粒转化菌蓝白筛选Fig.1Blue一whitescreeningofPlasmidtransformationofE.eoli酶切鉴定提取的空载质粒Ps讯NA一DUO一GFPzeo用内切酶Hindm单酶琼脂糖电泳鉴定，并与空载质粒Hindm单酶切后产物用0.8%鉴定做对比(见图2)。通过酶切后电泳图谱分析，可以看到提粒与用于转化的空载质粒符合理论预期，是同一质粒载体。切反应体系如下:取的空载质粒PsiRNA一DUO一GFPzeo用Hindlll单酶切反应体的空载质粒2川

轻轻混匀后，37oC水浴加热3h，后置80℃水浴20min灭活，即用或一20OC保存备用。空质粒单酶切产物0.8%琼脂糖电泳鉴定，见图2 M:makerDNAS林l，6X缓之中液l林l;l:提取空载质粒5林l，6X缓之，}‘液l林l;2:空载质粒5排l，6X缓冲液l林l; M:Themakerd一gest一on;2:图2:M表示 makerDNAI:提取空载质粒2:空载质粒F一 9.2EleetroPherogramofdigestedPsiRNA一DUO一GFPzeo ;l:TheextractlonofthePlasmld(PsiRNA一DUO一 GFPzeo)withHlnd111 ThePsiRNA一DUO一GFPzeow一 thHind111digestion2.3重组质粒psiRNA一GFP一CTGF和psiRNA一GFP一Tl淤一1的制备2
【学位授予单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R575.2

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本文编号：2601586