肝细胞组织化反应器的构建及应用研究

发布时间：2020-03-29 06:38

【摘要】：肝脏是维持人体正常生理活动的主要器官之一,近年来由于肥胖和糖尿病等发病率的持续增加,肝脏中糖和脂肪代谢的生理和病理研究尤其受到关注。肝细胞体外培养为肝脏病理和药理研究提供了高通量且成本低廉的研究工具。由于肝细胞聚集体培养最接近其体内的形态与结构,在维持细胞活率和功能上优于其他体外培养方式,因此被寄予厚望,但也面临调控规律和机理仍然缺乏的问题,这限制了其应用。因此,本文采用透明可视的水凝胶为研究平台,探索肝细胞自组装的调控规律和聚集机理,指导肝细胞组织化反应器的构建,并考察该反应器的糖和脂肪代谢水平及肝脏中降糖降脂药物的作用。首先,通过对海藻酸钙与PEG水凝胶三维空腔内肝细胞自组装的研究发现,空腔促进了肝细胞自组装,空腔构型、尺寸、细胞接入密度等因素均通过调节细胞的堆积层数影响聚集体的形态和功能,且在细胞堆积4层时,聚集活率和功能表达最高。此外,添加生物大分子有助于细胞聚集。自组装机理研究显示细胞的聚集过程受微丝和微管调控,同时随着聚集程度的增加,肝细胞整联蛋白的表达逐渐减弱而钙粘蛋白的表达增强。此外,肝细胞聚集过程中会重排胞外基质胶原。其次,本文通过对膜材料的筛选确定共混比为10%的PEG接枝聚砜中空纤维膜具有较优的促细胞聚集能力。采用水凝胶平台中获得的较优促细胞聚集参数,构建了基于中空纤维膜的肝细胞组织化反应器。该反应器中肝细胞可在18 h内快速形成柱状聚集体,其活率、尿素／白蛋白分泌量以及I相代谢酶活性等肝功能指标均优于三明治培养方式,且更接近体内肝脏表达水平。此外,该反应器也适用于人源性肝细胞的培养。最后,对上述组织化反应器进行糖和脂肪代谢功能和反映降糖降脂药物作用的评价。结果发现,相对于单层贴壁与三明治培养方式,组织化反应器的糖和脂肪代谢能力更接近体内肝脏水平,且可维持4d以上；且该反应器可较敏感地响应胰岛素、胰高血糖素等激素的刺激和高葡萄糖浓度作用后的毒性反应。正如我们所料,该组织化反应器能比较正确地反映PPAR激动剂类降糖降脂药物(曲格列酮、GW501516以及非诺贝特)对肝脏糖、脂代谢水平及相关基因表达的调节作用。综上所述,促进肝细胞自组装的组织化反应器在肝特异性功能、糖和脂肪代谢水平以及反映降糖降脂药物作用情况等方面均更接近体内肝脏的行为。本研究不仅充实了组织化反应器的设计理念,也为肝细胞反应器在肝脏生理和病理等领域更好的应用奠定了基础。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R575

【参考文献】