臭氧化盐水通过激活Keap1-Nrf2-ARE通路保护肝组织细胞的研究

发布时间：2020-03-29 05:05

【摘要】：化学物质肝脏代谢主要分为两相,Ⅰ相代谢(phase 1)主要是体内小分子物质(如谷胱甘肽、葡糖醛酸、维生素E等)直接与氧化物或毒性物质反应,使其失活减少毒性,此反应为快速反应。Ⅱ相代谢(phase 2)是酶促反应,在Ⅱ相代谢酶如过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)、环氧化物水解酶(epoxide hydrolase)、磺基转移酶(sulfotranserase)、乙酰基转移酶(acetyltransferase)、醌氧化还原酶I (quinone oxidoreductasel,NQO1)等的催化下,将内源性极性小分子物质经共价键结合到外来物质或Ⅰ相代谢活化物的分子上,使之亲水性增强,促进其排出体外。它们能消除有害物质对机体DNA及生物功能蛋白的破坏,以维持机体内环境的稳定,因此诱导Ⅱ相代谢酶基因的表达可以增强机体抗氧化、抗突变和抗肿瘤的能力。Ⅱ相代谢酶的启动子区域有特定的DNA序列即抗氧化反应元件(antioxidant responsive element, ARE),可通过化学预防剂、氧化应激或者亲电子物质诱导激活。 细胞转录因子Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2)属于碱性亮氨酸拉链(bZIP)蛋白质家族,是包括p45、Nrf1、Nrf2、Nrf3在内的CNC(cap'n'collar)转录因子家族成员中活力最强的转录调节因子,主要在代谢性和解毒组织器官中表达,如肝脏、肾脏及其它持续暴露于环境中的组织如皮肤、肺、消化管等。Nrf2是细胞调节抗氧化应激反应的重要转录因子,通过与抗氧化反应元件相互作用,可上调多种抗氧化酶及解毒酶,提高谷胱甘肽及超氧化物歧化酶等抗氧化物质的表达水平,维持细胞内的氧化还原平衡状态,发挥细胞保护作用。Nrf2生理状态下位于细胞质中,与胞浆蛋白伴侣分子Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1)结合,处于无活性状态,并瞬即降解。Keap1是一个与胞浆肌动蛋白结合的含624个氨基酸的多肽,包含NTR、BTB/POZ、IVR、DGR、CTR5个区。DGR区(double glycine repeat, DGR)含有6个双甘氨酸重复序列,是Keap1与Nrf2的Neh2区结合位点,也是Keap1与胞浆内肌动蛋白结合区位。BTB/POZ区的作用是介导Keap1二聚体化并与Nrf2-Keap1结合力有关,BTB/POZ区Ser-104突变影响Keap1二聚体化,可干扰Keap1锚定Nrf2的功能。Keap1与亲电子化合物及氧化剂的反应发生在插入区IVR,这与IVR区富含半胱氨酸有关。同时IVR区参与泛素化连接酶形成,因此与Nrf2稳定性有关。在活性氧或其他亲核剂信号刺激下,Keap1或者Keap1的DGR区构象发生变化,Nrf2进而从Keap1上解离出来,Nrf2与Keap1解偶联后被激活转移入细胞核中,和其他蛋白质Maf、JunD、cJun、ATF4等结合形成稳定异二聚体后,与位于Ⅱ相代谢酶基因的上游启动子区域的抗氧化反应元件上的GCTGAGTCA位点结合,调控下游Ⅱ相代谢酶基因的表达,增加细胞对氧化应激的抗性或耐受性。由此可见Keap1-Nrf2-ARE通路在Ⅱ相解毒酶基因的表达中发挥了关键的作用。目前研究证实,Keap1-Nrf2-ARE通路在抗肿瘤、抗应激、调节GSH合成、抗凋亡、抗炎症反应、抗动脉粥样硬化以及调节心脑血管反应、神经保护等方面发挥着广泛的细胞保护功能,Keap1-Nrf2-ARE系统是抵抗各种环境应激和内源性应激防御机制中必不可少的部分。Nrf2缺失或激活障碍可导致几种常见的病理现象,包括化学物致肿瘤形成的易感性、药源性急性肝毒性、对外来化合物以及紫外线的敏感性增高。目前Keap1-Nrf2-ARE通路的诱导物主要有迈克尔反应受体类(michael reaction acceptors)、联苯芬类(diphenols)、苯醌类(quinones)、异硫氰酸盐(isothiocyanates)、过氧化物类(peroxides)、硫醇类(mercaptans)、三价砷类(trivalent arsenicals)、重金属类(heavy metals)。 臭氧(ozone,O3)是氧气的同素异构体,由3个氧原子组成的分子,空气中不稳定、常温常压下半衰期约45 min转化成氧气。臭氧可溶于水,5分钟达到饱和,溶解度随着注入蒸馏水的臭氧浓度的增大而升高,相同条件下溶解度为氧气的10倍,5℃条件下臭氧水半衰期为110小时。医用臭氧是指由医用纯氧通过浓度可精密调控的臭氧发生器产生的氧气与臭氧的混合气体,可用于临床治疗。医用臭氧被认为是二十世纪新的气体分子药物。医用臭氧由于具有改善循环、调节免疫及抗炎镇痛等功能,现已用于创伤或褥疮愈合、椎间盘突出症、外周血管疾病、病毒性肝炎、糖尿病、肿瘤辅助治疗、类风湿性关节炎、关节炎及疼痛等治疗。医用臭氧作为一种强氧化剂,适当的剂量和较小的浓度,可以诱导Ⅱ相抗氧化酶的产生。研究发现医用臭氧直肠灌注预处理后能够减轻CCl4所致犬肝损伤,但其作用机制尚不清楚。医用臭氧自体血回输疗法是臭氧全身应用治疗的主要方法,已应用30余年,尽管副作用少安全性高,但需要抽血100ml用于体外臭氧化,受外周血管状况的影响,临床应用不方便。探索臭氧化液体静脉输注方法替代臭氧自体血疗法的努力一直未间断。1994年Bocci等发现生理盐水亦可臭氧化,能很好地保存臭氧及其衍生物,但认为高浓度臭氧化生理盐水(臭氧浓度80μg/ml)静滴对血管有刺激性,静脉滴注可能引起化学性静脉炎。俄罗斯学者临床实践发现低浓度臭氧化生理盐水静脉滴注与臭氧自血治疗一样对一些患者有效,无明显副作用。 基于以上认识,本研究尝试用医用臭氧溶于生理盐水制成饱和的臭氧盐水(Ozonized Saline,OS),利用CCl4大鼠急性肝损伤动物模型,来探讨静脉应用臭氧盐水对CCl4中毒大鼠肝脏的治疗保护作用及其作用机理,为医用臭氧的临床应用提供理论依据。 第一部分臭氧化盐水对四氯化碳诱导的大鼠肝细胞氧化损伤的保护作用 方法： 采用40只成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为8组,每组5只。第1组：正常对照组(NC组)；第2组：O2盐水组(模型组)；第3～8组：OS组(实验组),OS组(分为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml6个不同浓度组)予5ml/kg OS、模型组予5ml/kg氧气盐水每日尾静脉注射,连续15天,第16天予50%CCl4橄榄油溶液2ml/kg腹腔注射造肝损伤模型。正常对照组无任何预处理,正常喂养15天,第16天予橄榄油溶液2ml/kg腹腔注射1次。CCl4造模或橄榄油溶液注射24小时后,检测大鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肝组织总抗氧化能力(TAOC)、还原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、过氧化氢酶(CAT)水平。提取大鼠肝组织的核蛋白,运用免疫印迹方法测定其细胞核中Nrf2的含量,免疫荧光组织化学技术检测细胞内Nrf2的分布。 结果： 1)与NC组比较,模型组ALT、AST均显著升高(P0.01),肝组织TAOC、GSH、GPx、CAT显著降低(P0.01),模型成功。 2)与NC组比较,不同臭氧浓度OS组ALT、AST显著升高(P0.05),肝组织TAOC、GSH、GPx、CAT降低,部分差异有统计学意义(P0.05)。 3)与模型组比较,5～50μg/ml6个不同臭氧浓度OS组ALT、AST均显著降低(P0.05),不同浓度OS组ALT、AST水平亦不同,以30μg/mlOS组最低,ALT、AST较模型组分别降低56.5%(P=0.007)、56.2%(P=0.000),差异有统计学意义,30μg/mlOS组ALT、AST与其他浓度的OS组比较部分差异有统计学意义(P0.05)。 4)与模型组比较,5～50μg/ml6个不同臭氧浓度OS组TAOC、GSH、GPx、CAT升高,部分差异有统计学意义(P0.05)。其中30μg/mlOS组TAOC、GSH、GPx、CAT较模型组分别升高90.3%(P=0.000)、114.3%(P=0.000)、51.3%(P=0.001)、50.1%(P=0.013),差异均有统计学意义。 5)不同浓度OS组对大鼠抗氧化系统的影响亦不同,30μg/mlOS组TAOC、GSH、GPx、CAT与其他OS组比较,部分差异有统计学意义(P0.05)。 6)与NC组、模型组比较,OS组可明显增加Nrf2在细胞核中的含量,不同浓度OS所诱导的Nrf2含量也有差别,其中20-40μg/mlOS组含量较高。 7)各臭氧浓度OS静脉注射,大鼠未见化学性静脉炎、体重不升和大鼠死亡等不良事件发生。 第二部分30ug/ml臭氧化盐水对大鼠正常肝组织细胞的抗氧化能力的影响 方法： 根据前面实验的氧化损伤模型参数,采用10只成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为2组,每组5只。第1组：正常对照组(NC组)；第2组：30μg/ml OS组(实验组)。OS组予5ml/kg OS每日尾静脉注射,连续15天,第16天予3%戊巴比妥钠25mg/kg腹腔注射麻醉处死动物。正常对照组无任何预处理,正常喂养15天,第16天亦予3%戊巴比妥钠25mg/kg腹腔注射麻醉处死。手术留取肝组织,检测TAOC、GPx、CAT活性,利用免疫印迹法检测肝细胞核内Nrf2的含量,免疫荧光组织化学技术检测细胞内Nrf2的分布。 结果： 1)与NC组比较,30ug/mlOS预处理可使大鼠肝组织TAOC、GPx、CAT活性升高,分别升高TAOC活性升高31.4%(P=0.005),GPx升高21.0%(P=0.023),CAT活性升高14.2%(P=0.040),差异均有统计学意义。 2)免疫印迹及免疫荧光均显示OS能增强肝细胞核内Nrf2的表达。 全文结论： 1)臭氧化盐水静脉注射预处理可使CCl4诱导的大鼠急性肝损伤减轻； 2)臭氧化盐水对CCl4中毒大鼠肝损伤的预防保护作用存在剂量-效应关系,以臭氧浓度为30μg/ml臭氧化盐水疗效最佳； 3)臭氧化盐水可以通过激活大鼠肝组织细胞Keap1-Nrf2-ARE通路,诱导抗氧化酶的合成、提高大鼠总抗氧化能力来保护肝脏免受氧化应激损伤。Keap1-Nrf2-ARE通路的激活在臭氧抗氧化过程中发挥了作用。
【图文】：

图1Keapl一NrfZ一ARE通路调节机制Figurel.regulatingmeehanismofKeaPl一NrfZ一AREPathway研究证实，KeaPI一NrfZ一ARE通路在抗肿瘤、抗应激、调节GSH合成、凋亡、抗炎症反应、抗动脉粥样硬化以及调节心脑血管反应、神经保护等方
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R575

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