SIRT1调控磺基转移酶SULT1E1和SULT2A1参与肝脏脂质代谢的机制研究

发布时间：2020-03-29 04:28

【摘要】：【背景】随着肥胖和代谢综合征(metabolic syndrome,MetS)在全球范围内的流行,非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的发病率正在逐年增加,目前已经成为全球范围内危害人类健康的主要慢性肝脏疾病。由于NAFLD的发病机制极为复杂,至今尚未阐明,所以目前仍然没有批准用于治疗NAFLD的药物。不管是经典的“二次打击”假说还是近来提出的“多重平行打击”假说都认为肝脏脂质代谢紊乱引起的肝细胞内脂质的大量过度堆积是引起NAFLD的起始核心机制。因此阐明肝脏细胞内脂质代谢紊乱的分子机制及寻找潜在的NAFLD治疗靶点显得尤为重要。近年研究发现蛋白的乙酰化/去乙酰修饰在肝脏的能量代谢稳态调节方面扮演了重要的角色。沉默信息调节因子1(SIRT1)是目前研究较为深入的一种NAD+依赖的蛋白去乙酰化酶,可以通过使细胞内的组蛋白和非组蛋白脱去乙酰基而调节其活性,从而广泛参与细胞衰老、能量代谢、肿瘤发生以及生物节律等生命过程。已有研究报道在NAFLD小鼠模型以及临床NAFLD病人的肝脏中SIRT1表达明显下调,而采用SIRT1小分子激动剂能显著改善NAFLD动物模型的疾病进展,提示SIRT1在肝脏脂质代谢调控中发挥关键作用。但SIRT1调控肝脏脂质代谢的具体分子机制尚未阐明。随着组学和生物信息学技术的快速发展和日益成熟,本研究将以SIRT1为切入点,借助蛋白质和基因组学技术,阐明SIRT1调控肝脏脂质代谢参与NAFLD发生发展的分子机制,为干预NAFLD提供特异性的治疗靶点。【目的】1.筛选肝脏脂质代谢紊乱中SIRT1相关的关键分子2.筛选及鉴定SIRT1相互作用分子3.明确候选关键分子SULT1E1/SULT2A1在调控肝脏脂质代谢中的作用4.阐明SIRT1调控候选关键分子参与肝脏脂质代谢的分子机制【方法】1.将繁殖获得的肝脏SIRT1特异性敲除的SIRT1~(LKO)小鼠与对照SIRT1~(flox)的小鼠分别给予高脂饮食和普通饮食,诱导NAFLD模型,首先通过实时定量PCR(Q-PCR),蛋白印迹(Western blot)和免疫组化(IHC)检测SIRT1~(LKO)小鼠肝脏SIRT1表达水平,进一步通过检测体重、血糖、血清游离脂肪酸(FFA)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、胰岛素耐量试验(IPITT)、葡萄糖耐量实验(IPGTT)等指标确定NAFLD模型的成功建立及观察小鼠的糖脂代谢和胰岛素抵抗水平,进一步通过各组小鼠肝脏组织HE染色和油红O染色观察SIRT1的缺失在不同饮食状态下对小鼠肝脏脂肪变的影响。构建FASN-GLuc荧光报告基因小鼠,并通过体内体外成像以及胰岛素刺激实验进行验证。2.联合运用Label-free定量蛋白质组学技术和cDNA基因芯片技术,从转录水平和蛋白表达水平,高通量筛选小鼠肝脏SIRT1特异性敲除后在不同饮食状态下差异表达基因,并通过生物信息学技术分析差异基因所涉及到的信号通络,筛选与脂质代谢密切相关的候选分子;利用Q-PCR和Western blot方法检测候选的关键分子在小鼠肝脏和人肝细胞系中的表达水平,最终锁定2-3个关键分子进行下一步研究。3.采用油酸(oleic acid,OA)或棕榈酸(palmitic acid,PA)诱导的方法建立体外肝细胞脂肪变模型,借助细胞高内涵分析系统确定OA和PA诱导肝细胞脂肪变形成的合适浓度和最佳刺激持续时间,进一步构建候选分子SULT1E1/SULT2A1过表达的人L02肝细胞系,在OA和PA的合适浓度和最佳刺激持续时间作用下,采用脂质特异性荧光染料BODIPY或者尼罗红染色(Nile red)脂滴,通过高内涵系统进行观察和定量统计,明确SULT1E1/SULT2A1对肝脏脂质代谢的作用,同时采用Q-PCR和Western blot检测过表达SULT1E1/SULT2A1在OA和PA诱导下对肝脏脂质代谢相关基因表达的影响。4.构建带有Flag标签的SIRT1过表达L02细胞系,采用免疫共沉淀技术富集SIRT1相互作用分子,利用Label-free定量蛋白质组学技术筛选和鉴定SIRT1相互作用分子,通过生物信息学技术分析,筛选与脂质代谢相关的互作分子HLTF,并通过免疫共沉淀实验证实,进一步借助转录因子预测软件预测HLTF与SULT1E1/SULT2A1启动子区域的结合位点;构建带有HA标签的HLTF过表达L02细胞系,观察其对脂质代谢的影响及对SULT1E1/SULT2A1转录调控作用。【结果】1.Q-PCR,Western blot和IHC结果表明SIRT1~(LKO)小鼠肝脏SIRT1的表达明显下降,实现了肝细胞SIRT1特异性敲除;普通饮食的SIRT1~(LKO)小鼠与对照SIRT1~(flox)小鼠的体重、血糖、FFA、ALT和AST的水平无明显差异,而高脂饮食的SIRT1~(LKO)小鼠的体重、血糖、血清甘油三脂、ALT和AST水平明显高于高脂饮食的SIRT1~(flox)小鼠;IPITT和IPGTT试验结果表明高脂饮食的SIRT1~(LKO)小鼠的糖耐量受损和胰岛素抵抗加重;各组小鼠肝脏HE和油红O染色结果显示高脂饮食的SIRT1~(LKO)小鼠的肝脏脂肪变更加严重。2.联合采用Label-free定量蛋白质组学技术,cDNA基因芯片技术和生物信息学分析技术,从蛋白质水平和基因mRNA水平高通量筛选SIRT1相关的参与肝脏脂质代谢的分子,其中质谱鉴定出上下调的差异蛋白分别为21个和10个,基因表达谱芯片鉴定上下调差异基因分别为70个和45个,通过生物信号通路分析,发现差异大部分参与了肝脏的糖、脂、氨基酸代谢,肝脏发育以及内质网应激等生物过程,我们重点关注与脂肪代谢密切相关10个候选关键分子;Q-PCR和Western blot结果表明候选关键分子的表达受到SIRT1的调控,并且与组学数据结果一致,最终确定SULT1E1/SULT2A1为后续研究分子。L02细胞系中过表达SIRT1抑制SULT1E1/SULT2A1的基因表达水平,免疫共沉淀实验结果表明SIRT1与SULT1E1/SULT2A1并不存在直接相互作用。3.成功建立SULT1E1/SULT2A1过表达的人L02肝细胞系,采用OA和PA成功诱导体外肝细胞脂肪变模型,通过细胞高内涵分析系统确定在OA100uM和PA200uM诱导12小时的条件下,肝细胞脂肪变性非常显著;在此诱导条件下,油红染色、BODIPY染色和尼罗红染色结果显示SULT1E1/SULT2A1过表达促进肝细胞内脂滴形成;Q-PCR和Western blot结果显示过表达SULT1E1/SULT2A1促进了脂肪合成相关基因ChREBP和FASN的表达。4.通过免疫共沉淀富集SIRT1相互作用蛋白,Label-free定量蛋白质组学技术筛选51个SIRT1相互作用分子,其中已报道30个,新发现21个,经过生物信息学分析,发现鉴定出的相互作用分子主要参与了能量代谢、氧化应激等信号通路,其中HLTF可以与SULT1E1和SULT2A1的启动子区域。HLTF被选定为重点研究分子,成功建立HLTF过表达的人L02肝细胞系,并通过免疫共沉淀技术证实SIRT1-HLTF存在相互作用,发现SULT1E1/SULT2A1的表达受到HLTF的调控。【结论】1.以高脂饮食诱导SIRT1~(LKO)小鼠NAFLD脂肪变模型,联合采用蛋白质组学和基因组学数据,通过生物信息学分析,本研究获得了一组与SIRT1密切相关的参与肝脏脂质代谢的分子,并构建了肝脏脂质代谢障碍中SIRT1介导的分子网络图。2.明确了候选关键分子SULT1E1/SULT2A1通过调控脂肪代谢相关基因ChREBP和FASN促进肝细胞脂肪合成的分子机制3.通过质谱鉴定出一批新的SIRT1相互作用蛋白,免疫共沉淀证实了HLTF是SIRT1的直接作用分子,进一步证实HLTF可以转录调控SULT1E1/SULT2A1的表达参与肝脏脂质代谢。
【图文】：

疾病谱,脂肪合成,脂质代谢

图 1 NAFLD 疾病谱及病理特征（Cohen JC et al. Science. 2011）前尚无批准的用于临床治疗 NAFLD 的特异性药物，各种 NAFLD 临床控制结合运动作为主要治疗方法，导致患者依从性差，疗效甚微和疾病要原因与我们对 NAFLD 的发病机制认识不足有关。因此，深入细致D 发生发展的分子机制，寻找有效的预防和治疗方法显得尤为迫切。FLD 的发病机制尚未阐明理状态下肝脏脂质代谢通路脏是人体内脂质代谢的主要器官，正常生理状态下肝脏内的脂质代谢以下几个方面：在脂肪合成相关转录因子过氧化物酶体增殖物激活R-γ），固醇调节元件结合蛋白 1c（SREBP-1c）和碳水化合物反应元件hREBP）等的调控下，以及脂肪合成相关酶类的催化下，以糖等原料从；在脂肪酸 β 氧化相关转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体- （PP下，氧化脂肪酸为机体提供能量；在肝内合成的甘油三酯与 apoB100/a

生理状态,代谢过程,肝脏,假说

图 2 生理状态下肝脏 TG 代谢过程（Cohen JC et al. Science. 2011）二次打击”与“多重平行打击”假说AFLD 发生发展的分子机制极其复杂并且涉及多个因素，尽管在这个领的进步，，但对非酒精性脂肪肝的发病机制的认识仍然是不全面的，迄D 的发病机制尚未完全阐明。基于 NAFLD 发生进展过程中胰岛素抵抗，炎症反应等主要的病理性特征，多种假说被提出用来解释 NAFLD 发机制。其中最早提出被大家广泛认可的是“二次打击”假说。该假说击是胰岛素抵抗引起的肝内脂肪过度聚集形成脂肪变性，而胰岛素抵变性又会加重肝内脂质代谢紊乱，从而形成恶性循环；第二次打击是的脂质过氧化从而导致肝脏炎症损伤和肝脏纤维化[10]。但是随着D 的深入研究发现“二次打击”假说过分单纯化而不能全面概括 NAFL程中涉及的多个平行因素，不能很好的用来解释 NAFLD 的发病机制。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R575.5

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