氧化石墨烯对肠炎小鼠肠上皮细胞损伤的影响及机制研究

发布时间：2020-03-29 12:10

【摘要】：研究背景和目的炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn's disease,CD),它是累及肠道的慢性、炎症性、毁损性疾病。目前认为,遗传和环境因素共同作用启动机体异常免疫是IBD的主要病因之一,但其具体机制尚不明确。新型纳米材料氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)在日常社会生产及生活中应用广泛。因此,其长期暴露对肠道炎症的影响逐渐受到重视。为了更好的了解GO暴露对IBD发生发展的影响,本研究在应用硫酸葡聚糖钠(Dextran sulfate sodium,DSS)成功构建急性小鼠肠炎模型的基础上探讨了 GO对其肠道炎症的影响,并且通过体外建立肠上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IECs)模型进一步探究了其潜在机制。方法1.GO的理化性质和表征:使用原子力显微镜(Atomic force microscopy,AFM)、透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM)观察GO表面形态、原始粒径以及厚度。利用拉曼光谱(Raman spectroscopy)检测GO材料内部缺陷。另外,使用动态光散射仪(Dynamic light scanning,DLS)检测GO在不同溶剂中的稳定性和分散性,并用平均粒径、多分散指数(Polydipersity index,PDI)和zeta电位来评估。2.动物模型的构建和分组:6-8周大小的雌性C57B1/6小鼠饮用2.5%DSS溶液长达5 d成功构建急性肠炎模型,后恢复正常饮用水4 d,动物实验周期共9d。小鼠分组如下:WT组(无任何处理)、WT-GO组(仅灌胃GO)、DSS-WT组(仅DSS处理)和DSS-GO组(在DSS处理的基础上灌胃GO),分别在造模第2、4、6、8天分别给小鼠予以5、30以及60 mg/kg剂量的GO溶液灌胃。3.体内实验的观察指标:日常记录小鼠体重及大便性状,于第9日行颈椎脱臼法处死小鼠。收集结肠组织进行HE染色观察肠道炎症情况、qPCR检测炎症因子表达情况以及TUNEL染色观察肠道凋亡情况。4.肠上皮细胞模型的构建:在体外实验中,选用人正常结肠黏膜上皮细胞,FHC细胞作为肠上皮细胞模型。5.GO在肠上皮细胞内的定位情况:使用TEM及免疫荧光显微镜分别观察GO或FITC-BSA标记的GO的摄取和在细胞内的分布。6.GO对肠上皮细胞毒性作用的影响:不同浓度GO(0、10、25、50、100和200 μg/mL)处理FHC细胞24 h以及0、25和50μg/mL GO分别处理细胞6、12和24 h,使用毒性增殖实验(Cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒和乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)释放试剂盒分别检测细胞活力和细胞上清中LDH含量;选用25和50μg/mLGO处理FHC细胞24h,LPS处理组作为阳性对照组,利用实时荧光定量PCR(quantantive PCR,qPCR)检测炎症因子IL-6、IL-10、IL-1β以及TNF-α的表达情况。另外,利用Western blot检测p65蛋白表达。7.GO对肠上皮细胞线粒体和ROS的影响:分别使用TEM观察GO处理后FHC细胞线粒体结构以及流式细胞技术仪检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP);应用免疫荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞内ROS生成。8.GO对肠上皮细胞凋亡的影响:使用流式细胞技术仪检测细胞凋亡数量。提取蛋白进行Western blot,检测凋亡相关蛋白,包括CytC、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3以及AMPK信号通路相关蛋白的表达;9.GO诱导细胞凋亡机制的研究:使用抗氧化剂N-acetyl-L-cysteine(NAC)清除细胞内ROS和AMPK抑制剂Compound C(Com.C)抑制FHC细胞内AMPK通路活性后,检测凋亡相关指标和信号通路的变化;结果1.GO的表征和稳定性:使用AFM观察到本研究中所使用的GO为不规则片状结构,厚度约为1.0 nm,粒径主要在200-300 nm之间。使用TEM观察到的GO结构与AFM结果基本一致,且GO表面不光滑,边缘锐利。拉曼光谱结果显示GO的D峰和G峰的峰值分别为1835 cm-1和1521 cm-1。根据DLS结果得知,GO在双蒸水、PBS以及RPMI 1640培养基溶液中静置12 h至5 d时,其主要粒径均在200-300 nm之间。然而,在静置长达7 d时GO在不同溶剂中的稳定性存在明显差异。GO在双蒸水中仍然比较稳定,PDI始终保持在1.0。而GO在PBS和RPMI 1640培养基中的PDI分别下降为0.7和0.5。2.GO加重了DSS肠炎小鼠的肠道炎症:在体内使用DSS成功构建肠炎小鼠模型,并发现予以60 mg/Kg GO溶液灌胃处理可以加重小鼠肠炎,表现为小鼠体重持续下降、结肠长度明显缩短、上皮结构完全破坏以及炎症细胞严重浸润。qPCR结果显示,与DSS-WT组相比较,DSS-GO组小鼠肠道IL-6和IL-17表达明显上调,而IL-10表达显著下调。TUNEL染色发现,DSS-GO组小鼠肠道上皮组织内发生了明显的凋亡。然而,在WT组与GO-WT组小鼠肠道中均未观察到明显病理异常。3.GO经FHC细胞摄取后诱导细胞产生明显的细胞毒性:GO经FHC细胞摄取后主要分布细胞胞浆,且GO对FHC细胞活力的抑制作用和对LDH释放的促进作用均与处理时间、处理浓度呈正相关;另外,GO诱导了炎症因子IL-1β的释放。4.GO能诱导线粒体损伤并诱导细胞内ROS生成:GO诱导了线粒体损伤,表现为结构破坏以及MMP明显下降;同时,胞内观察到明显的ROS生成。5.GO能诱导FHC细胞凋亡的发生:相比于对照组,GO处理能诱导更多的FHC细胞发生凋亡,且伴随细胞内凋亡相关蛋白CytC、Bax和cleaved caspase-3表达上调以及Bcl-2表达下调。同时,GO能显著激活FHC细胞内的AMPK/p53信号通路。6.GO诱导的FHC细胞凋亡受ROS/AMPK/p53通路调控:使用NAC清除细胞内ROS和Com.C抑制AMPK通路后能明显减轻GO诱导的细胞凋亡。结论1.GO可以加重DSS诱导的急性肠炎,但对于无炎症基础疾病的正常健康小鼠肠道无明显损伤。2.GO能够诱导FHC细胞产生细胞毒性、细胞膜破坏释放LDH、线粒体损伤、ROS生成以及细胞凋亡。3.GO诱导ROS/AMPK/p53通路激活调控的肠上皮细胞凋亡可能是其加重小鼠急性肠炎的主要机制。
【图文】：

高峰,原始粒径,拉曼光谱分析,化性

第三章结果逡逑１．邋ＧＯ的表征和理化性质逡逑本研宄中所使用的ＧＯ成品，根据图１－１邋Ａ所示，ＡＦＭ结果显示ＧＯ呈单逡逑层片状结构，，可见最大粒径约５００邋ｎｍ，但其主要粒径分布在２００－３００邋ｎｍ之间。逡逑ＧＯ的厚度约ｌｎｍ，符合ＧＯ作为单层纳米结构的基本特征。同时，本研宄使用逡逑ＴＥＭ更为清晰、直观地表征ＧＯ表面形态和结构。如图１－１邋Ｂ所示，ＴＥＭ下观逡逑察到的结果与ＡＦＭ结果基本一致，且ＧＯ边缘锐利，表面不光滑。图１－１邋Ｃ结逡逑果为ＤＬＳ所测得的ＧＯ原始粒径分布图，粒径在２００－３００邋ｎｍ之间。为了进一步逡逑验证本实验中使用的ＧＯ为公认的石墨烯衍生物，使用拉曼光谱分析了邋ＧＯ的结逡逑构缺陷和特异性高峰。在图１－１邋Ｄ中观察到ＧＯ具有两个特征性高峰，分别为Ｄ逡逑峰（Ｄ邋ｐｅａｋ）和Ｇ峰（Ｇ邋ｐｅａｋ）。拉曼光谱表征显示Ｇ邋ｐｅａｋ峰值位于１５２１邋ｃｍ－１

示意图,小鼠,灌胃,示意图

图２－１－１．小鼠造模示意图逡逑６－８周大小的雌性Ｃ５７Ｂ１／６小鼠分组如下：ＷＴ组（未做任何处理）、ＷＴ－ＧＯ组（灌胃逡逑ＧＯ）、ＤＳＳ－ＷＴ组（仅给予ＤＳＳ处理）以及ＤＳＳ－Ｇ０组（在ＤＳＳ造模的基础上给予ＧＯ处逡逑理），每组小鼠共５只。通过２．５％邋ＤＳＳ溶液暴露给小鼠达５邋ｄ后更换正常饮用水４邋ｄ构建急逡逑性肠炎模型，于第２、４、６、８天分别灌胃５、３０以及６０邋ｍｇ／ｋｇ的ＧＯ溶液暴露给小鼠。于逡逑第９日处死小鼠，收集结肠组织备用。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１－１．邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ邋ｉｎ邋ｖｉｖｏ逡逑６－８邋ｗｅｅｋｓ邋ｏｌｄ邋ｆｅｍａｌｅ邋Ｃ５７Ｂ１／６邋ｍｉｃｅ邋ｗｅｒｅ邋ｄｉｖｉｄｅｄ邋ｉｎｔｏ邋ｆｏｕｒ邋ｇｒｏｕｐｓ邋（ｎ＝５，邋ｅａｃｈ邋ｇｒｏｕｐ）：邋ＷＴ逡逑ｇｒｏｕｐ邋（ｗｉｔｈｏｕｔ邋ＤＳＳ邋ｏｒ邋ＧＯ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ），邋ＧＯ－ＷＴ邋ｇｒｏｕｐ邋（ｏｎｌｙ邋ＧＯ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ），邋ＤＳＳ－ＷＴ邋ｇｒｏｕｐ邋（ｏｎｌｙ逡逑ＤＳＳ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）邋ａｎｄ邋ＤＳＳ－ＧＯ邋ｇｒｏｕｐ邋（ＧＯ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｓｅｔｔｉｎｇ邋ｏｆ邋ｃｏｌｉｔｉｓ邋ｉｎｄｕｃｅｄ－ｂｙ邋ＤＳＳ逡逑ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）．邋Ｔｏ邋ｉｎｄｕｃｅ邋ａｎ邋ａｃｕｔｅ邋ｃｏｌｉｔｉｓ邋ｍｏｄｅ，邋ｍｉｃｅ邋ｗｅｒｅ邋ｇｉｖｅｎ邋２．５％邋ＤＳＳ邋ｉｎ邋ｄｒｉｎｋｉｎｇ邋ｗａｔｅｒ邋ｆｏｒ邋５逡逑ｄａｙｓ邋ａｎｄ邋ｔｈｅｎ邋ｇｉｖｅｎ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｄｒｉｎｋｉｎｇ邋ｗａｔｅｒ邋ｆｏｒ邋４邋ｄａｙｓ．邋Ｍｉｃｅ邋ｗｅｒｅ邋ｏｒａｌｌｙ邋ａｄｉｍｉｎｉｓｔｒａｔｅｄ邋ｗ
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R574

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