【摘要】：[目的] 研究发现乙型肝炎病毒(HBV)可以感染多种免疫细胞,巨噬细胞作为免疫细胞能否被HBV感染及其感染机制目前尚不清楚。微颗粒是具有双层脂质结构的囊状小体,多项研究表明其可作为细胞间传递信息和物质的载体。本研究从HBV阳性患者外周血中分离微颗粒与巨噬细胞混合培养后,检测巨噬细胞HBV颗粒以及不同蛋白的表达,探讨微颗粒介导HBV感染巨噬细胞的可能性。进一步探讨HBV感染细胞后对Grp78及MHC-I表达的调控作用。 [方法] 1.从HBV阳性患者的外周血中分离微颗粒作为实验组,来自HBV阴性个体外周血的微颗粒作为对照组； 2.从两组中采集一部分微颗粒做荧光染色(PKH-26标记微颗粒,FITC标记HBV),并使用激光共聚焦显微镜观察微颗粒内是否包涵HBV,其余微颗粒与巨噬细胞(U937细胞)混合培养8h及24 h； 3.采用PKH-26和CFSE分别对微颗粒和巨噬细胞染色； 4.采用激光共聚焦显微镜观察巨噬细胞内微颗粒； 5.采用透射电镜观察巨噬细胞内HBV病毒颗粒； 6.采用细胞免疫组化方法检测巨噬细胞内HBcAg表达；ELISA法检测巨噬细胞内和上清内HBsAg和HBeAg的表达：采用细胞免疫荧光方法检测巨噬细胞内HBcAg和HBx蛋白表达； 7.采用real-timePCR方法分别检测巨噬细胞内HBV DNA和HBV-cccDNA水平,同时检测巨噬细胞培养上清中HBV DNA水平； 8.分离提取被HBV感染的巨噬细胞释放的微颗粒,与新的巨噬细胞混合培养后采用real-timePCR方法检测细胞内HBV DNA水平。 9.转染HBx质粒至HepG2细胞,采用流式细胞术研究HepG2细胞表面MHC-Ⅰ、Grp78和MICA/B分子的表达情况； 10.采用双光子共聚焦显微镜观察细胞表面MHC-1分子和Grp78分子的定位情况； 11.通过siGrp78和HBx质粒共转染以及siHLA和HBx质粒共转染至HepG2细胞,采用流式细胞术研究HepG2细胞表面MHC-Ⅰ及Grp78分子的表达； 12.转染HBx质粒至T2细胞和H22细胞,采用流式细胞术研究两种细胞表面MHC-Ⅰ、Grp78分子的表达； 13.将NK细胞与转染HBx质粒的H22细胞共同培养,采用流式细胞术观察NK细胞对后者的杀伤效应。 [结果] 1.共聚焦显微镜观察可见来自HBV阳性患者外周血的微颗粒内包涵有HBV。混合培养8h后,可在巨噬细胞内发现微颗粒。 2.混合培养24 h后,可通过透射电镜在HBV阳性组巨噬细胞内观察到HBV病毒颗粒。 3.混合培养24 h后,经免疫组化染色发现巨噬细胞内HBcAg染色呈阳性,细胞免疫荧光方法检测到巨噬细胞内有HBcAg和HBx蛋白表达；而对照组未观察到病毒颗粒以及HBcAg及HBx蛋白表达； 4. ELISA结果提示HBV阳性组巨噬细胞通过冻融和裂解两种方法提取的抗原及培养上清内的HBsAg和HBeAg表达呈阳性,对照组则呈阴性； 5.定量分析结果显示,混合培养24 h以后,实验组巨噬细胞内HBV DNA、HBV-cccDNA水平和巨噬细胞培养上清液的HBV DNA水平均明显高于对照组； 6.分离提取了三代被HBV感染的巨噬细胞释放的微颗粒,与未感染的巨噬细胞混合培养后,结果提示,连续四代细胞内HBV DNA水平均呈阳性。 7.转染HBx质粒后HepG2细胞MHC-Ⅰ和Grp78表达升高,MICA/B分子表达则无明显变化； 8.双光子共聚焦显微镜发现HepG2细胞表而MHC-1分子和Grp78分子表现为共定位情况,提示二者以复合体形式存在于细胞表面； 9. SiGrp78和HBx质粒共转染以及siHLA和HBx质粒共转染至HepG2细胞后发现MHC-Ⅰ与Grp78分子的表达具有相关性。 10.NK细胞对于转染HBx质粒的H22细胞杀伤效率下降。 [结论] HBV阳性患者外周血的微颗粒包涵有HBV,并可介导感染巨噬细胞,提示携带HBV的微颗粒可作为HBV感染巨噬细胞的载体,HBV通过微颗粒感染巨噬细胞后可以在巨噬细胞内复制,并可通过释放微颗粒的方式不断感染更多的巨噬细胞。HBx可上调感染细胞表面的MHC-Ⅰ类分子Grp78的表达。MHC-Ⅰ类分子和Grp78的表达具有相关性,两种分子处于共定位状态,以复合体形式存在于细胞膜表面；由于HBx上调MHC-Ⅰ与Grp78分子的表达,NK细胞对感染细胞的胞毒活性受阻。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R512.62
【参考文献】
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