肝病患者血浆中相关miRNA和mRNA的检测分析

发布时间：2020-03-31 00:04

【摘要】：microRNA(miRNA)是一类长约19-24nt的非编码内源性小分子RNA,在生物进化过程中高度保守,miRNA不编码蛋白,绝大多数miRNA可以通过与靶基因3,UTR区互补结合,抑制靶基因翻译成蛋白质,进而在细胞、组织甚至个体水平上影响生物体的生长发育,并参与多种疾病的发生发展。根据生物信息学预测,人类基因组内存在着上千个miRNA基因,调控基因组内1/3左右基因的表达。近年来,miRNA分子机制的快速发展不仅揭示了miRNA的生理功能,而且解释了多种疾病包括癌症相关miRNA的异常表达模式。研究发现健康人血液中存在有上百种miRNA,由于来自疾病组织的miRNA在血液中避开了内源核糖核酸酶的活性,具有相当的稳定性,而且这些miRNA在血液中的含量足够多,很有可能会在疾病的临床诊断中发挥重要作用。miRNA几乎参与了肿瘤发生及发展的每一步过程,因此miRNA在肿瘤的早期诊断、预警及治疗等方面均有良好的应用前景。本研究主要是为了寻求肝病血浆中异常表达的miRNA,利用本实验室建立的poly(A)加尾实时定量RT-PCR技术定量检测健康血浆及肝病患者血浆中相关miRNA的表达情况,目的是要比较肝病患者血浆与健康人血浆中相关miRNA的差异。本研究首先完善了TRI Reagent法提取血浆miRNA的实验流程,确定了本实验条件下合适的血浆用量以及血浆与TRI Reagent试剂比例。其次,定量检测了miR-21、miR-221、miR-224在健康人血浆及肝病患者血浆中的表达水平。再次,已有研究证实肝癌血浆中存在甲胎蛋白(AFP)mRNA、丙酮酸激酶(PKM2)mRNA和白蛋白(ALB) mRNA,所以本研究中同时关注了其在健康人血浆及乙肝肝硬化患者血浆中的表达情况。主要研究进展如下: 1.完善了血浆miRNA提取实验流程。确定了血浆与TRI Reagent的比例为1:5时提取效果相对较好,血浆用量大于800μl时提取的总RNA适于血浆中miRNA加尾RT-PCR检测分析。 2.检测发现miR-21、miR-221及miR-224在肝病患者血浆中的量明显高于健康人血浆。通过对肝病患者进行临床分型,统计分析表明miR-21、miR-221及miR-224在不同类型肝硬化患者血浆中的量高于健康人。 3.分析临床检测指标与所检测的miRNA量之间的关系,发现所检测的miR-21、miR-221及miR-224除了与个别的临床检测指标相关外,与大多临床检测指标的相关性不大。 4.在健康人血浆及乙肝肝硬化患者血浆中检测了AFP mRNA、PKM2 mRNA和ALB mRNA的表达水平,发现这三种mRNA在健康人血浆和乙肝肝硬化患者血浆中均存在差异性表达。 5.分析检测的mRNA与临床检测指标间的相关性,通过非参数检验证实所检测AFP mRNA和PKM2 mRNA与临床检测指标间的相关性不大,而ALB mRNA与γ-谷氨酰基转移酶(GGT)及血清白蛋白(ALB)间具有相关性。总之,本研究采用实时定量PCR技术检测了肝病患者血浆中相关miRNA及mRNA的表达情况,重点关注了肝硬化患者血浆中相关miRNA和mRNA的表达水平变化,这为深入研究肝癌发生过程中血浆相关miRNA和mRNA的变化提供了依据。通过更加深入的大样本和长期随访研究将有可能发现肝癌早期预警的微RNA分子标志物。该项研究将有助于人们加深对肝脏疾病的了解。
【图文】：

作用方式,生成过程,生物标志物

图1 miRNA在细胞中的生成过程及作用方式[3]清 miRNA环 miRNA 与肿瘤形成的相关性已成为研究的热由于不易被 RNase 降解，具备良好的稳定性，因本文主要总结了血浆 miRNA 的异常表达与肿瘤[4]报道称循环miRNA作为癌症诊断的生物标志[5]和Gilad 等[6]的相关研究证实miRNA的这种潜其中有些miRNA的异常表达仅与某种特定肿瘤的异常表达可能与两种以上肿瘤的发生存在1、miR-17-92及let-7似乎在跨组织的肿瘤发生中标志物的特异性及简便性比较显著，这证明基会带来生物标志物领域的新变革。的血清miRNA生物标志物是miR-21，Charles 等

健康人血浆,血浆,内参,表达水平

男4 31 16 3 0性别女 3 8 0 2 5平均值±标准差58±14 50±10 48±8 54±18 49±18年龄平均值(范围)58（ 40-81）50（31-71）48（37-68）54（35-72）49（25-70）3. 实时定量 PCR 检测健康人血浆与肝病患者血浆中 miRNA 的表达在循环外体 miRNA 的研究中，已有大量文献证实 miR-21 与多种癌症（胃癌[11]、胰腺癌[12-15]、卵巢癌[14]、B 细胞性淋巴瘤[16]等）的发生发展密切相关而且 Lawrie 等[16]研究称 miR-21 很可能是弥散性大 B 细胞性淋巴瘤的临床诊断标志物，，所以在研究中检测了 miR-21 在健康人血浆及肝病患者血浆中的表达，结果证实 miR-21 在肝病患者血浆中的表达与健康人血浆中的表达存在差异，提示 miRNA 可能与肝病的发展进程有关。见图 2.1。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R575

【参考文献】