骨髓间充质干细胞促进重症急性胰腺炎后胰腺组织损伤修复的实验研究

发布时间：2017-03-22 04:11

  本文关键词：骨髓间充质干细胞促进重症急性胰腺炎后胰腺组织损伤修复的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：急性胰腺炎是临床上常见的急腹症之一，其中10-20%可发展为重症急性胰腺炎。该类型是一种病情凶险、并发症多、预后差、死亡率高的严重疾病。目前，临床上对SAP的治疗缺乏特异有效的治疗方法。据相关文献报导，骨髓间充质干细胞（Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）参与了急性胰腺炎的发病过程，并能减轻病情，，改善预后，提高生存率，但BMSCs对SAP的作用机制目前尚不完全清楚。本课题以SD大鼠SAP为动物模型，给予SAP雄性大鼠移植同种异体BMSCs，观察输注后大鼠胰腺的病理损伤修复情况，并初步探讨SMSCs对SAP大鼠胰腺损伤的修复机制。 一、大鼠骨髓间充质干细胞的提取、分离、培养和鉴定 目的：体外分离、培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞并进行表面抗原鉴定及多向分化能力检测，以建立稳定的BMSCs体外培养、扩增体系，供日后的实验做准备。 方法：取健康成年的雄性SD大鼠，在无菌的条件下，取大鼠双下肢，分离胫腓骨，于超净台剪开骨端，PBS彻底冲洗骨髓腔直至发白，1500rpm离心10分钟，弃上清，大鼠淋巴细胞分离液（Ficoll液）分离单个淋巴细胞，取单个淋巴细胞DMEM-LG培养基中培养。在24小时内观察细胞贴壁情况。首次传代后继续观察生长情况，继而传至第三代（P3）时，收取细胞并计数，进行BMSCs的鉴定。 结果：在培养基中24H后BMSCs开始贴壁，呈纺锤丝及三角等形态生长聚集，并有集落样生长。经过几次传代培养后，细胞纯化，至P3代时细胞形态均一。表面抗原鉴定： BMSCs流式细胞仪检测其抗原,高表达CD29、CD90、低表达CD45、CD34；诱导分化能力鉴定：BMSCs诱导分化为成骨和成脂细胞。 结论： 采用Ficoll密度梯度离心和体外细胞贴壁分离培养法相结合建立稳定的SMSCs原代和传代培养方法。 二、大鼠重症胰腺炎模型的建立 目的：制作SD大鼠SAP动物模型，为研究胰腺损伤修复提供可靠的动物模型。 方法：健康成年雄性SD大鼠共60只，体重250-300g，随机分为2组：对照组（N=25）；模型组（N=25）。对照组大鼠仅翻动胰腺，模型组分为6H、12H、24H、48H、72H5个时间点，每个时间点5只大鼠。余10只大鼠均制作SAP，观察72H生存率。实验大鼠禁食12H，自由饮水。浓度为5%牛磺胆酸钠，行胆胰管逆行注射。在制模后各时间点检测血清淀粉酶，胰腺和肺HE染色，并依据schmidt评分法评分。观察两组动物72H存活率。 结果：血清淀粉酶水平6H（6526.191454.79）、12H(7683.501806.41)、24H(9501.002111.76)、48H(4516.671715.32)、72H（38851682.67）均显著高于对照组（P0.05）,胰腺组织schmidt评分均明显高于对照组（P0.05）。两组死亡率分别为0和70%。模型组病检可见6H：小叶间隙增宽，炎性细胞浸润。12H：胰腺细胞坏死。24H：胰腺组织大面积坏死，出血和炎性细胞明显。48H：胰腺组织坏死，胰腺细胞坏死，腺泡结构消失，大量炎性细胞（中性粒细胞、淋巴细胞）浸润；72H：大量腺细胞坏死，炎性细胞浸润。 结论：采用5%牛黄胆酸钠成功制作SD大鼠SAP模型。由于在24H时胰腺损伤最为严重，我们在24H时间点选择BMSCs干预治疗。 三、骨髓间充质干细胞促进重症急性胰腺炎后胰腺组织损伤修复的实验研究 目的：明确同种异体BMSCs能否减轻SAP大鼠病情，能否对其胰腺损伤具有保护或修复作用。 方法：将制模成功的SAP模型大鼠随机分为3组：对照组（N=5）；SAP+培养基组（N=5）：接受相应体积的培养基。SAP+BMSCs组（N=5）：输注BMSCs，约5-7106/只。干预后24H，提取血清测定AMY、ALT、CR、LDH和TNF-和INF-；获取胰腺组织用于HE染色，病理评分和检测IL-1、IL-6、 IL-10表达情况。另取培养基组和BMSCs组各10只大鼠观察72H存活情况。 结果：三组AMY、ALT、CR、LDH两两比较，均有显著差异；培养基组血清中TNF-和INF-与BMSCs组相比较，差异显著；BMSCs移植组胰腺组织中TNF-和INF-表达低于培养基输注组（P0.05）。BMSCs移植组大鼠的72小时生存率明显高于培养基组。 结论： BMSCs的移植可以减轻SAP大鼠胰腺病理损伤，改善病情，提高生存率。 四、同种异体骨髓间充质干细胞在重症急性胰腺炎大鼠体内的迁移 目的：利用Y染色体检测，明确雄性大鼠BMSCs在雌性大鼠内迁移，并初步探讨BMSCs减轻SAP病情的机制。 方法：对照组：正常雌性大鼠3只，输注（约1106/只）雄性BMSCs，实验组：雌性24H制模后SAP大鼠3只，等体积BMSCs，输注24H后提取胰腺、肾脏、肝脏、心脏和肺，检测雄性Y染色体DNA。 结果：实验组中胰腺组织雄性Sry阳性更为明显。 结论：证实移植的同种异体骨髓间充质干细胞，能够定植在受损的部位，发挥其抗炎和修复作用。 全文小结 采用Ficoll密度梯度离心和贴壁分离法相结合可以分离、陪养、扩增出较均一具有较强增殖分化能力的BMSCs；采用5%牛黄胆酸钠成功诱导了与临床高度相仿的SAP大鼠模型。BMSCs可以改善SAP病情，提高SAP大鼠的存活率。BMSCs定植到受损部位，发挥其抗炎和修复等作用。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 胰腺炎模型 移植 损伤修复 迁移
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R576
【目录】：

• 英文缩略词表5-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-16
• 前言16-20
• 第一部分：大鼠骨髓间充质干细胞的提取、分离、培养和功能鉴定20-35
• 实验材料21-23
• 实验方法23-28
• 结果28-32
• 讨论32-35
• 第二部分：大鼠重症急性胰腺炎模型的建立35-52
• 实验材料35-37
• 实验方法37-42
• 结果42-47
• 讨论47-52
• 第三部分：骨髓间充质干细胞促进重症急性胰腺炎后胰腺组织损伤修复的实验研究52-68
• 实验材料52-54
• 实验方法54-60
• 结果60-65
• 讨论65-68
• 第四部分：同种异体骨髓间充质干细胞在重症急性胰腺炎大鼠胰腺归巢的研究68-75
• 实验材料68-70
• 实验方法70-72
• 结果72-73
• 讨论73-75
• 结论75-76
• 参考资料76-86
• 致谢86-87
• 综述87-94
• 参考文献91-94
• 在读期间发表的论文目录94

【参考文献】

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本文编号：260851