在HepG2细胞与HMCs细胞中探讨炎症因子对肝X受体α启动子活性的影响

发布时间：2020-03-31 22:24

【摘要】：第一部分肝X受体α启动子虫萤光素酶质粒的构建 目的：本部分旨在构建人类肝X受体α启动子的虫荧光素酶重组质粒。 方法：以HepG2细胞DNA为模板扩增肝X受体α启动子序列，将扩增产物经限制性内切酶双酶切后与同样双酶切的pGL3-Basic载体进行连接并进行鉴定。 结果：将重组质粒进行双酶切鉴定及测序分析证明成功构建了LXRα启动子的荧光素酶报告质粒（pGL3-Basic-LXRα-P）。 结论：利用已知的启动子序列结合生物信息学资源能准确快速的构建出启动子虫荧光素酶重组质粒。 第二部分在HepG2细胞中探讨炎症因子对肝X受体α启动子活性的影响 目的：在HepG2细胞中观察炎症因子对肝X受体α启动子活性的影响，从而探讨HepG2细胞内胆固醇积聚的分子机制。 方法：将构建的LXRα基因启动子的虫荧光素酶报告质粒转染HepG2细胞同时转染海肾荧光素酶报告基因载体pRL-TK作内参照，利用双荧光素酶报告基因系统检测炎症因子对LXRα启动子活性的影响，进一步将HepG2细胞分为对照组（control）、炎症组（TNFα20ng/ml）、高脂组（LDL,100ug/ml）及联合处理组（TNFα20ng/ml+LDL100ug/ml）。采用实时定量PCR和Western Blot检测HepG2细胞中LXRα、ABCG1、ABCA1基因mRNA和蛋白的表达水平。用油红O染色和定量比色法分析HepG2细胞内胆固醇的含量。 结果：炎症因子能明显抑制LXRα启动子的活性。进一步检测发现，和对照组相比，炎症因子下调了LXRα、ABCA1、 ABCG1mRNA与蛋白表达。油红O染色和定量结果显示，炎症因子使细胞内脂质明显增加。 结论：炎症因子可能通过抑制LXRα启动子活性，，干扰LXRα受体途径从而抑制HepG2细胞内胆固醇的外流，导致肝细胞内脂质异常积聚。 第三部分在HMCs细胞中探讨炎症因子对肝X受体α启动子活性的影响 目的：在HMCs细胞中观察炎症因子对肝X受体α启动子活性的影响，从而探讨HMCs细胞内胆固醇积聚的分子机制。 方法：将构建的LXRα启动子的虫荧光素酶报告质粒与海肾荧光素酶报告基因载体共转染至HMCs中，采用双荧光素酶基因报告系统观察炎症因子对LXRα启动子活性的影响，进一步将HMCs细胞分为对照组（control）、炎症组（TNFα20ng/ml）、高脂组（LDL,100ug/ml）及联合处理组（TNFα20ng/ml+LDL100ug/ml）。采用实时定量PCR和Western Blot检测HMCs细胞中LXRα、ABCA1基因mRNA和蛋白表达水平。用油红O染色和定量比色法分析HMCs细胞内胆固醇的含量。 结果：炎症因子能明显抑制LXRα启动子的活性。进一步检测发现，和对照组相比，炎症因子下调了LXRα与ABCA1mRNA与蛋白表达。油红O染色和定量结果显示，炎症因子使细胞内脂质明显增加。 结论：炎症因子可能通过抑制LXRα启动子活性，干扰LXRα受体途径从而抑制HMCs细胞内胆固醇的外流，导致肾脏细胞内脂质异常积聚。
【图文】：

LXRα的启动子片段

图 2.2 PCR 筛选重组质粒 2.2 Screening of recombinant plasmid bM DNA Marker2 Positive colony
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R575.5

【参考文献】

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1 孙晓红,陈明杰,潘迎捷;启动子克隆概述[J];食用菌学报;2002年03期

2 李琦;周利红;王炎;孙珏;高虹;范忠泽;;pGL3-Basic-COX-2-promoter报告基因重组质粒的构建及其功能鉴定[J];世界华人消化杂志;2008年31期

3 杨晓娜;赵昶灵;李云;李会容;苏丽;周燕琼;;启动子序列克隆和功能分析方法的研究进展[J];云南农业大学学报(自然科学版);2010年02期

本文编号：2609652