肝特异性转录因子CREBH在非酒精性脂肪性肝炎中的作用及其机制的研究

发布时间：2020-04-07 01:34

【摘要】：目的:探索CREBH在代谢应激细胞模型和NASH小鼠模型中的作用。方法:1.通过不同浓度的H2O2、LPS分别刺激人肝癌细胞系Hep G2诱导肝细胞发生代谢应激,用PA干预小鼠肝细胞系AML-12诱导肝细胞发生脂肪变,采用Western Blot和q RT-PCR的方法检测CREBH在代谢应激细胞模型中的表达水平。2.采用q RT-PCR和Western Blot的方法检测CREBH在MCD饮食诱导的NASH模型中的表达水平。3.通过尾静脉注射过表达CREBH的AAV8载体的方法,上调小鼠体内CREBH的表达量,再分别给予MCS/MCD和NCD/FFC两种饮食方案诱导小鼠NASH模型,在特定时间点收集肝组织标本,采用HE染色、ORO染色和天狼星红染色观察上调CREBH对饮食诱导的NASH模型小鼠肝组织损伤的影响。结果:1.在H2O2诱导肝细胞发生氧化应激时,N-CREBH随着H2O2干预浓度的增加而激活;采用LPS刺激肝细胞发生炎性损伤时,N-CREBH出现低水平活化,但活化水平与干预浓度不成正比;在PA诱导肝细胞发生脂肪变的体外模型中,我们发现不同浓度的PA干预AML-12可显著激活N-CREBH。综上提示H2O2、LPS和PA等代谢应激信号均可激活CREBH,使N-CREBH表达明显增加。2.我们通过MCD饮食成功建立了NASH小鼠模型。与MCS饮食对照组相比,CREBH m RNA的表达量在MCD 4W、6W和8W组均显著下调,且在模型组中其表达量呈逐渐下降的趋势。Western Blot检测发现:与MCS饮食对照组相比,F-CREBH和N-CREBH蛋白的表达量在MCD 4W、6W和8W模型组中均显著下调。3.在MCD饮食诱导的小鼠NASH模型中,MCD+AAV8 Crebh组与MCD+AAV8Vector相比,肝细胞脂肪变、炎性细胞浸润和红色胶原纤维明显减少,提示上调CREBH可显著改善MCD饮食诱导的NASH肝组织损伤;同时,我们通过FFC饮食建立了小鼠NAFLD向NASH进展的模型,该模型肝细胞脂肪变较MCD模型明显,但炎症细胞浸润和纤维化反应轻于MCD模型。在FFC饮食诱导的小鼠NASH模型中,FFC+AAV8 Crebh组与FFC+AAV8 Vector相比,肝细胞脂肪变性、炎性细胞浸润和胶原纤维沉积显著减轻,提示上调CREBH可显著改善FFC饮食诱导的NASH肝组织损伤。结论:代谢应激分子可显著激活CREBH的表达,提示CREBH在肝细胞炎性应激性模型中发挥潜在的保护作用;在MCD和FFC两种饮食诱导的小鼠NASH模型中,过表达CREBH可显著改善NASH小鼠肝组织损伤。目的:探索上调CREBH改善饮食诱导的NASH模型小鼠肝组织损伤的潜在机制。方法:1.尾静脉注射过表达CREBH的AAV8病毒载体后,给予MCD饮食诱导NASH模型,于4W、6W、8W时分批处理老鼠,收集肝组织标本和血清进行分子生物学检测。采用生化试剂盒检测各组小鼠肝组织内TG、TC的含量,以及血清ALT和AST的差异。采用ELISA方法检测各组小鼠血清中炎症因子MCP1、IL-1β和TNFα的表达水平。采用免疫组化法对各组小鼠肝组织石蜡切片进行F4/80,CD68和MPO染色,对比各组肝组织内Kuffer细胞和中性粒细胞的浸润情况。2.在各组小鼠肝组织标本中,采用q RT-PCR法筛选CREBH可能调节的脂质代谢关键分子和炎症因子。采用Western blot验证筛选出来的脂质分子SCD1、SREBP-2和炎症相关分子IL-1β、MCP1和IL-6的表达水平。3.通过慢病毒过表达CREBH感染小鼠AML-12细胞系,构建稳定转染的CREBH细胞,采用报告基因荧光素酶检测和染色质免疫共沉淀等分子生物学的方法,研究CREBH是否能够在基因水平上转录调控SCD1或MCP1的表达。结果:1.在持续8W的MCD饮食干预下,与MCS对照组相比,肝组织内TG、TC的含量在MCD模型组中组显著上调。AAV8 Crebh组小鼠肝组织内TG、TC的含量与AAV8 Vector对照组相比显著下调,血清ALT、AST也显著下调。ELISA结果表明AAV8 Crebh组小鼠血清中MCP1,TNFα和IL-1β的含量与AAV8 Vector对照组相比出现显著下降。肝组织切片免疫组化染色发现,与MCD+AAV8 Vector对照组相比,MCD+AAV8 Crebh过表达组肝组织内Kuffer细胞、中性粒细胞显著减少。2.在MCD饮食(4W、6W和8W)的干预下,与AAV8 Vector对照组相比,SCD1、PPARα和CPT1a的m RNA在AAV8 Crebh组显著上调,SREBP-2 m RNA在AAV8 Crebh组显著下调;同时,MCP1、IL-6和IL-1β的m RNA水平在AAV8 Crebh组均较对照AAV8 Vector组显著下调,而Tnfα在4W时的MCD+AAV8 Crebh组未出现显著下调,COX2 m RNA和HO-1 m RNA则与AAV8 Crebh的干预未出现显著的相关性。进一步的蛋白水平检测发现:在持续8W的MCD饮食干预下,与AAV8 Vector对照组相比,SCD1蛋白表达量在AAV8 Crebh组显著上调,MCP1显著下调。SCD1和MCP1在m RNA和蛋白水平均与CREBH的上调呈现显著的相关性。3.通过报告基因荧光素酶检测和Ch IP发现,CREBH能与脂代谢基因SCD1和炎症因子MCP1的基因启动子片段结合,而过表达CREBH后,SCD1的启动子报告基因荧光素酶活性显著上调,而MCP1的启动子报告基因荧光素酶活性则显著下调。结论:CREBH通过基因水平转录激活去饱和酶SCD1的启动子,使SCD1在m RNA和蛋白水平表达均显著增加,并通过直接转录抑制炎症因子MCP1的启动子,改善NASH小鼠的肝组织炎症损伤。
【图文】：

活化水,实验结果,平图,小鼠模型

图 1：不同干预情况下 CREBH 的表达与活化水平中，A 为 HepG2 的实验结果；B 和 C 为 AML-12 的实验结果。**p < 0.01度分别为 0、125、250、500 μM 的 H2O2干预 HepG2 细胞，于干预后 16进行 F-CREBH、N-CREBH 和 p-IRE1（内质网应激的标记）蛋白质检测10、20、40 μg/ml 的 LPS 干预 HepG2 细胞，于干预 16 h 后收集细胞进测。用 0、200、400、600 和 800 μM 的 PA 干预 AML-12 细胞，于干预 24 h 进行 CREBH mRNA 的检测。用 0、200、400、600 和 800 μM 的 PA 干预 AML-12 细胞，于干预 24 h 进行 F-CREBH 和 N-CREBH 蛋白水平的检测。ASH 小鼠模型的建立及 CREBH 在 NASH 小鼠模型肝组织中的表达情况2.1 为了明确 CREBH 在肝脏炎症损伤中的作用及其机制，我们采用 MC

HE染色,肝组织,小鼠,大泡

华中科技大学博士学位论文肝组织 HE 染色，我们发现在 MCS 对照小鼠肝组织中，未见明显异常改CD 饮食分别干预小鼠 4W、6W 与 8W 后，小鼠肝组织出现明显的大泡性脂区和小叶内大量炎性细胞浸润和肝细胞气球样变，随着造模时间的延长，变逐渐加重，8W 时，，模型组肝组织内可见炎性细胞呈灶状聚集，表明我饮食成功建立了小鼠 NASH 模型。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R575.1

【参考文献】