建立高效HBV血清型检测方法及综合HBV血清型和基因型的流行病学研究

发布时间：2020-04-09 01:03

【摘要】：乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus,HBV)引起的一种传染病,全球范围内普遍存在且严重影响人类健康。HBV感染对肝脏可引起不同程度的损害,包括急性自愈性感染、慢性肝炎、暴发性肝炎、肝硬化和肝癌。目前,以乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B Surface Antigen,HBsAg)作为基础,将 HBV 分为 adw、adr、ayw 和 ayr四个主要的血清型,同时,根据全基因组核苷酸序列的差异将HBV分为A～19个基因型。目前的很多研究表明,HBV血清型与基因型在乙肝临床表现、病情进展、对干扰素治疗和预后等方面都有不可忽视的影响。HBV的血清型与基因型在不同的人种及地区之间的分布有所差异,而研究探讨这部分内容则有助于对HBV的临床结局分析、抗病毒疗效以及HBV基因突变位点的分析,对进一步认识HBV的生物学特性具有重要意义。本研究将建立一种特异性强、准确性高的检测HBV血清型的ELISA方法,探讨我国乙肝患者HBV血清型及基因型的分布特点及其与临床的关系,具体进行以下方面的研究:1.建立分泌抗HBsAg表位单克隆抗体细胞株以HBsAg亚型蛋白adr、adw、ay作为抗原免疫小鼠。经过三次免疫后,小鼠尾部血清效价在1×10-4左右。经过细胞融合技术和杂交瘤筛选技术,筛选出4株分泌特异性识别HBsAg表位“d”、“y”、“r”、“w”抗体的杂交瘤细胞株,代号分别为#2.1-4.2、#7-7-2、#18.1-23-3.1 和#56.2-71-5.2。2.抗HBsAg表位单克隆抗体的获得将4株细胞株在无血清培养基MD6中大量培养,通过Protein A进行亲和层析纯化,获得单克隆抗体。利用间接ELISA方法对获得的四株单克隆抗体的特异性进行分析,结果表明#2.1-4.2特异性识别HBsAg“d”表位,#7-7-2特异性识别HBsAg“y”表位,#18.1-23-3.1特异性识别HBsAg“r”表位,#56.2-71-5.2特异性识别HBsAg“w”表位。另外,#2.1-4.2 与#7-7-2 不竞争同一表位,#18.1-23-3.1 与#56.2-71-5.2 不竞争同一表位。四株抗体的亲和力均在109L/mol以上。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,抗体轻、重链条带明显,无其它杂带。#2.1-4.2、#18.1-23-3.1及#56.2-71-5.2的单克隆抗体重链亚型为IgG2b,#7-7-2的重链亚型为IgG1,四株单克隆抗体的轻链亚型均为κ。我们根据HBsAg血清型氨基酸序列设计了四条多肽序列R1、W1与R2、W2,利用ELISA方法鉴定抗体的抗抗原位点。结果显示,#18.1-23-3.1抗体相对应的抗原位点可能是R1的氨基酸序列,#56.2-71-5.2抗体相对应的抗原位点可能是W1的氨基酸序列。3.特异性HBV血清型检测方法的建立利用以上四株单克隆抗体为原料建立一种特异性HBV血清型检测方法,并对包被浓度、HRP二抗使用浓度、反应温度及时间进行了优化,检测各ELISA的灵敏度及特异性。首先,将四种单克隆抗体进行HRP标记,计算出最佳工作浓度后(1:8,000),与抗“a”表位的单克隆抗体#3-11-2.1分别组合成双抗体夹心ELISA。经过对ELISA条件的优化及比较,结果显示,#3-11-2.1的最佳包被浓度为1.0 μg/mL,样本最佳加样量为10μL;ELISA样本反应温度为37℃,反应时间为30 min,且一步法ELISAL比两步法ELISA检测的准确率高。对建立的检测方法做出以下评价:(1)特异性较高,#3-11-2.1抗体包被,#2.1-4.2-HRP作为二抗的夹心ELISA方法能特异性地检测“d”表位;同样,#3-11-2.1包被,#7-7-2-HRP的夹心ELISA能特异性地检测“y”表位;#3-11-2.1包被,#18.1-23-3.1-HRP 的夹心 ELISA 检测“r”表位;#3-11-2.1 包被,#56.2-71-5.2-HRP 的夹心 ELISA 能特异性地检测“w”表位。(2)四种夹心方法都具有良好的线性区间,R值均在0.99以上,灵敏度在纳克级水平,批内变异系数均在10%以下,批间变异系数均在15%以下。(3)与PCR及测序方法比较,两种方法检测HBV血清型的结果差异不显著。4.我国HBV血清型及基因型的初步探讨收集HBV血清样本,通过建立的HBV血清型检测方法及PCR测序法,成功分析了这些样本的血清型及基因型。在408例HBV阳性样本中,adr血清型330例,adw血清型50例,ayr和ayw血清型各14例;B基因型116例,C基因型255例,D基因型37例,未发现A、E、F、G、H等基因型。不同血清型、基因型的性别分布没有显著差异。另外,不同血清型、基因型患者的年龄段分布没有显著差异。HBV基因组DNA(HBVDNA)水平、丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)水平以及HBeAg阳性率在各血清型以及基因型中差异显著。adr血清型中HBVDNA、ALT水平最高,其次是adw及ayr,最低的是ayw;HBeAg阳性率adw最高,其次是adr及ayw,最低为ayr。C基因型HBV DNA、ALT水平以及HBeAg阳性率最高,D基因型HBV DNA、ALT水平高于B基因型,B基因型HBeAg阳性率多于D基因型。HBV血清型与基因型在我国的分布有显著差异。Adr为我国主要血清型,在全国范围内均有所分布;adw血清型主要集中于南方地区;ayr及ayw主要分布在新疆地区。基因型C是我国的优势基因型,在各个地区均有分布;B基因型集中分布于华东、华中及华南地区;基因型D则主要出现在新疆地区。本研究建立的双抗体夹心ELISAHBV血清型检测方法准确、简便,而且,我们对来自中国大范围地区的HBV感染者样本同时进行血清型与基因型的检测,结果相对更具有代表性和真实性,更能准确地反应我国HBV感染者基因型及血清型的地理分布特征。这为研究病毒变异、探讨HBV发病机制和流行病学提供了有力工具。
【图文】：

基因组,形式,颗粒,脂质双层

ＨＢＶ主要以三种形式存在。第一种是圆球状颗粒，直径４２邋ｍｎ，是具有感染性的完逡逑整的ＨＢＶ。此种病毒在１９６５年由丹娜发现，所以又被称为丹娜颗粒（Ｄａｎｅ颗粒）。逡逑Ｄａｎｅ颗粒包括外壳和核心两个部分（如图１－２）。夕卜壳厚７－８邋ｎｍ，由脂质双层和蛋白质逡逑组成。脂质双层内有前Ｓ１蛋白、前Ｓ２蛋白和Ｓ蛋白，它们又构成了外壳大、中、小三逡逑种蛋白形式，统称为ＨＢｓＡｇ。核心颗粒直径２８邋ｎｍ，是呈二十面体立体对称的结构，它逡逑的表面是病毒真正的衣壳，称为ＨＢｃＡｇ，由１８３个氨基酸组成。Ｄａｎｅ颗粒的中心部位逡逑则是部分双链和单链的环状ＤＮＡ和依附在上面的ＤＮＡ聚合酶。第二种颗粒为小圆球逡逑颗粒，直径２２邋ｎｍ，是ＨＢｓＡｇ的主要组分，在血清中大量存在。这类颗粒是属于ＨＢＶ逡逑多余的衣壳蛋白，没有传染性，但可以刺激机体产生相应的抗体，所以具有中和病毒的逡逑作用，并可用于制备乙肝疫苗。ＨＢＶ第三种为管状颗粒，直径与第二种颗粒相同，长逡逑度为５０－２３０邋ｎｍ，均属于ＨＢｓＡｇ，也是ＨＢＶ多余的衣壳蛋白，同样也无传染性［１８

颗粒,脂质双层

ｍＲＮＡｓ逡逑＾翁逡逑ＡＡＡ＾逦—＊＾逡逑ＨＢｘｍＲＮＡ逡逑图１－１邋ＨＢＶ基因组［１７］逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｏｆ邋ＨＢＶ逡逑ＨＢＶ主要以三种形式存在。第一种是圆球状颗粒，直径４２邋ｍｎ，，是具有感染性的完逡逑整的ＨＢＶ。此种病毒在１９６５年由丹娜发现，所以又被称为丹娜颗粒（Ｄａｎｅ颗粒）。逡逑Ｄａｎｅ颗粒包括外壳和核心两个部分（如图１－２）。夕卜壳厚７－８邋ｎｍ，由脂质双层和蛋白质逡逑组成。脂质双层内有前Ｓ１蛋白、前Ｓ２蛋白和Ｓ蛋白，它们又构成了外壳大、中、小三逡逑种蛋白形式，统称为ＨＢｓＡｇ。核心颗粒直径２８邋ｎｍ，是呈二十面体立体对称的结构，它逡逑的表面是病毒真正的衣壳，称为ＨＢｃＡｇ，由１８３个氨基酸组成。Ｄａｎｅ颗粒的中心部位逡逑则是部分双链和单链的环状ＤＮＡ和依附在上面的ＤＮＡ聚合酶。第二种颗粒为小圆球逡逑颗粒，直径２２邋ｎｍ，是ＨＢｓＡｇ的主要组分，在血清中大量存在。这类颗粒是属于ＨＢＶ逡逑多余的衣壳蛋白
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R512.62;R181.3

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