Hotair在肝纤维化中的作用及其相关机制研究

发布时间：2020-04-09 01:26

【摘要】：肝纤维化是由病毒性肝炎,酗酒,代谢性疾病,自身免疫性疾病和胆汁淤积性肝病等持续肝损伤引起。在肝纤维化进展过程中,炎症和肝损伤引起复杂的细胞活动,导致胶原蛋白沉积和正常肝脏结构的破坏。在过去几十年,窦状静脉的肝星状细胞(HSC)被认为细胞外基质(ECM)的主要来源。在正常肝脏中,HSC是静息的,储存维生素A的脂肪细胞。然而,在肝纤维化后,HSC从静息的维生素A储存细胞到活化的肌成纤维细胞形态变化等相关的激活过程。此外,HSC活化与ECM组分合成和沉积显著相关,比如上调α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),胶原,金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP1),产生促纤维化细胞因子/生长,诸如转化生长因子-β(TGF-β),血小板衍生因子等。然而,调控HSC活化和肝纤维化的分子机制还未阐明。我们课题组最近的研究表明lnc RNA在HSC活化和肝纤维化中具有重要的作用。LncRNA是一类转录本长度超过200nt的RNA分子。最初,lnc RNA被认为是RNA聚合酶II转录的副产物,并无生物学功能。然而,近年的研究表明,lnc RNA在生物体重要生命活动中发挥着极广泛的调控作用,可通过参与m RNA的稳定和翻译水平的调节、蛋白质的运输、RNA的加工和修饰、影响染色体的结构等机制,调控生物体的胚胎发育、组织分化、器官形成等基本的生命活动,并参与肿瘤等疾病的病程相关过程。LncRNAs可通过多种途径调节miRNA、DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重构,在疾病的发生和发展中具有发挥重要作用。HOX转录本反义基因RNA(HOTAIR)位于染色体12q13.13上,长度为2158bp,在转录沉默中具有重要作用。HOTAIR能作用于核心蛋白复合体PRC2,改变H3K27甲基化和基因表达方式,导致肿瘤侵袭和转移性增强。HOTAIR在不同类型的癌症(包括乳腺癌,结肠癌和肝癌)中高度表达,并且HOTAIR表达与乳腺癌,结肠癌预后相关。HOTAIR表达与淋巴结转移和胃癌TNM分期显著相关。此外,敲减HOTAIR抑制胃癌细胞的侵袭转移能力。研究发现HOTAIR在肝癌中高表达,并且HOTAIR表达与肝癌患者存活负相关。但是HOTAIR在肝纤维化,尤其是对HSC的活化的相关作用尚未见报道。于是本实验重点研究HOTAIR在肝纤维化中的作用,尤其是对HSC活化增殖中的作用,为肝纤维化防治提供新的思路,阐明肝纤维化形成中相关的分子机制,对抗肝纤维化药物的研发,减少肝硬化及原发性肝细胞癌的发生具有十分重要的意义。主要研究内容概括如下:1.Hotair在纤维化的肝组织中表达上调首先检测CCl4处理的肝纤维化小鼠模型中Hotair的表达。采用免疫组化、荧光双染、RT-q PCR等方法检测Hotair的表达变化。另选取人体肝血管瘤组织作为正常对照组,肝癌患者癌旁2 cm以外作为肝纤维化组织。并使用免疫组化、荧光双染、RT-q PCR方法观察Hotair的表达及定位情况。结果发现,与正常肝组织相比,人体肝纤维化组织及小鼠肝纤维化组织中Hotair的表达明显增高,且主要表达于肝星状细胞。2.Hotair对HSCs活化的影响体外实验部分以人肝星状细胞株LX-2(活化的HSC)为研究对象,通过si-Hotair和Hotair过表达质粒转染LX-2细胞,利用CCK8实验观察LX-2细胞增殖情况;利用RT-q PCR和western blot观察LX-2细胞活化的情况。结果表明,与对照组比较,Hotair过表达促进LX-2细胞增殖和活化,而敲减Hotair抑制LX-2细胞增殖和活化。3.Hotair作为miR-148b的ce RNA促进DNMT1的表达进一步我们利用生物信息学方法结合荧光素酶报告基因,研究miR-148b是否靶向抑制Hotair和DNMT1。利用RT-q PCR和荧光素酶报告基因观察过表达miR-148b或抑制miR-148b对Hotair表达及荧光素酶活性的影响。结果表明,与对照组比较,过表达miR-148b导致Hotair荧光素酶活性和表达的减少,而抑制miR-148b诱导Hotair荧光素酶活性和表达的增加。此外,miR-148b显著抑制DNMT1的表达和荧光素酶活性。进一步通过荧光素酶,RT-q PCR和western blot检测表明,与对照组相比,在Hotair存在下,RLuc-DNMT1 3'-UTR抑制被逆转,同时DNMT1表达被逆转。4.Hotair通过抑制MEG3/p53促进HSC活化为进一步探讨Hotair影响HSC功能的相关分子机制,我们利用共转染技术,RT-q PCR和western blot研究MEG3是否参与Hotair对HSC的功能影响。敲减Hotair上调LX-2细胞中MEG3/p53表达,而过表达Hotair抑制MEG3/p53表达。此外,我们利用Hotair和MEG3质粒共转染LX-2细胞,CCK8实验,RT-q PCR和western blot方法观察LX-2的增殖和活化的情况。结果表明,与对照组比较,Hotair的过度表达促进了LX-2的增殖和活化,而MEG3过表达逆转Hotair介导的LX-2增殖和活化。5.Hotair/DNA通过PRC2抑制MEG3促进HSC活化为探讨Hotair是否通过互作组蛋白修饰(特别PRC2)调控基因的表达,我们利用CHIP-PCR,RNA免疫共沉淀,RT-q PCR和western blot等方法研究Hotair如何调控MEG3。结果显示,PRC2复合物EZH2和SUZ12能与Hotair结合。Hotair质粒和si-EZH2或si-SUZ12共转染LX-2细胞检测MEG3的表达水平,结果显示Hotair过度表达抑制MEG3的表达,而si-EZH2或si-SUZ12部分逆转Hotair介导的MEG3减少。此外,在LX-2细胞中,过表达Hotair诱导组蛋白H3K27me3显著富集在MEG3启动子。最重要的是,RNase Ch IP实验结果显示,RNase抑制剂处理后最大程度招募PRC2到MEG3启动子区域。用RNA酶H处理部分减少PRC2到MEG3启动子区域,而RNA酶A处理没有显著的抑制作用。
【图文】：

纤维化,活化的,肝脏,小鼠

安徽医科大学博士学位论文-SMA阳性细胞显著增加(Fig.1B)。如Fig.1C所示，RT-qPCR结果显示，CCl4处理的小鼠肝组织中α-SMA和Col1A1 mRNA表达显著增加，与正常组比较差异有显著性(p<0.01)。如Fig.1D所示，Western blot结果显示，模型组的肝组织中α-SMA和Col1A1 蛋白表达显著增加，与正常组比较差异有显著性（p<0.01）。如Fig.1E所示，RT-qPCR结果显示，，与对照组比较，CCl4处理2周和4周的小鼠中Hotair表达没有显著变化（p>0.05），但在6周Hotair表达显著增加(p<0.01)。为确定Hotair的上调是否发生在小鼠HSC或肝脏中的其他细胞类型，我们用Hotai（Hotair探针）和α-SMA（anti-α-SMA）进行了免疫荧光双标记实验。免疫荧光双标实验显示，活化的HSC（α-SMA阳性）在实验组小鼠肝纤维化的纤维束中表达高水平Hotair，而在正常小鼠肝脏中静息的HSC表达低水平的Hotair(Fig.1F)。上述结果提示Hotair可能主要定位在活化的HSC中。

纤维化,肝组织

图2. Hotair在人纤维化肝组织中的表达情况。Fig.2. Hotair expression in human liver fibrosis tissues, n=6 per group. (A) Pathology observation the patient liver sections stained with H&E staining and Sirium red (×100). The level of α-SMA wanalyzed by immunohistochemistry. Representative views from each group are presented (×100). (qRT-PCR analyzed mRNA expression of α-SMA and Col1A1 in human fibrotic liver tissue*p<0.05, **p<0.01 vs. control. (C) The protein expression of α-SMA and Col1A1 was analyzed bwestern blot in fibrotic liver tissues and control liver tissues. **p<0.01 vs. control. (D) Hotaexpression in human liver fibrotic tissues and control liver tissues. **p<0.01 vs. control. (F) ISwith anti-Hotair probe and IHC with α-SMA were performed to determine the co-localization Hotair (green) and α-SMA (red) in human liver fibrosis models(×400).
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R575.2

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