Hyper-IL-6重组慢病毒的构建及其促肝细胞增殖的研究

发布时间：2020-04-09 02:01

【摘要】： 目的:构建融合基因超级白介素6(Hyper-inerleukin-6,HIL-6),应用猫免疫缺陷病毒(feline immunodeficiency virus,FIV)为基础的慢病毒载体构建重组慢病毒FIV-HIL-6。用FIV-HIL-6感染人肝细胞HepG2,观察细胞内Hyper-IL-6 mRNA的表达情况。方法:采用基因拼接(GeneSOEing)的方法将人类sIL-6R和IL-6的基因用富含甘氨酸序列的接头经PCR扩增融合,并定向克隆至慢病毒载体的表达质粒pCDEF,再将表达质粒pCDEF-HIL-6和慢病毒载体的包装质粒瞬时共转染293T细胞,构建慢病毒载体FIV-HIL-6的包装体系。嘌呤霉素筛选的方法检测Hyper-IL-6重组慢病毒的病毒滴度。RT-PCR检测FIV-HIL-6感染靶细胞HepG2细胞后Hyper-IL-6基因的表达情况。结果:PCR扩增出1560bp的Hyper-IL-6编码序列并成功构建重组慢病毒质粒pCDEF-HIL-6,经鉴定证实构建的融合基因的编码序列与理论推断完全一致。重组慢病毒表达质粒pCDEF-HIL-6经BglII和EcoRI双酶切后,可见一条约1560kb的目的基因条带和质粒的条带,表明同源重组成功。将重组慢病毒表达质粒和包装质粒瞬时共转染293T细胞后,于荧光显微镜下可见绿色荧光。收集细胞上清液,得到重组慢病毒颗粒FIV-HIL-6,用嘌呤霉素筛选测定病毒滴度为107pfu/ml。将重组慢病毒颗粒感染肝癌细胞HepG2,并提取细胞总RNA,用RT-PCR方法能检测到HepG2细胞中表达出的Hyper-IL-6基因。结论:成功构建了重组慢病毒Hyper-IL-6,并在人肝肿瘤细胞HepG2中得到了Hyper-IL-6基因的表达,为以后进行急性肝衰竭的基因治疗等研究奠定了一定基础。目的:研究重组慢病毒FIV-HIL-6对人正常肝细胞L-02中急性时相蛋白——结合珠蛋白(Haptoglobin)mRNA表达的影响作用;同时观察Hyper-IL-6对L-02细胞促增殖作用的影响。方法:重组慢病毒FIV-HIL-6感染L-02细胞后,提取细胞总RNA,用RT-PCR方法检测结合珠蛋白的mRNA表达量的变化。用MTT法检测并分析FIV-HIL-6对L-02细胞生长状态的影响。结果:人正常肝细胞L-02在重组慢病毒FIV-HIL-6刺激下,L-02细胞的结合珠蛋白mRNA表达相对于未感染组、空病毒组(FIV组)及FIV-IL-6组有显著增高(F=7.85)。FIV-HIL-6组对L-02细胞的促增殖作用也明显高于对照组(p=0.0000)。结论:重组慢病毒FIV-HIL-6表达的Hyper-IL-6有显著的生物活性,能够显著刺激人正常肝细胞L-02结合珠蛋白mRNA的表达;并且对L-02细胞有显著的促增殖作用。
【图文】：

琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶,引物扩增,模板

1-1 总 RNA 琼脂糖凝胶电arose gel electrophresis o-6 的构建R 扩增后得到 1008bpP4 引物扩增出 591bp CR 产物为模板，用引 1-2）。

融合基因,琼脂糖凝胶电泳

图 1-1 总 RNA 琼脂糖凝胶电泳Fig1-1 1% Agarose gel electrophresis of the total RNA.1.2 融合基因 Hyper-IL-6 的构建以 P1、P2 为引物进行 PCR 扩增后得到 1008bp 大小的特异性条带（sIL-6R码基因加 Linker），，用 P3、P4 引物扩增出 591bp 的目的条带（Linker 加 IL-码基因），再以上述两次 PCR 产物为模板，用引物 P1、P4 扩增得到 1560byper-IL-6 融合基因片段（图 1-2）。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R575

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