NR2B参与雌激素介导心理应激内脏高敏感的机制研究

发布时间：2020-04-09 07:00

【摘要】： 研究背景肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是临床常见疾病之一。目前诊断仍然依靠症状、排他性诊断，缺乏生化标志物及解剖学异常。内脏高敏感是目前公认的IBS重要病理生理机制之一。近来发现NMDA受体与内脏高敏感的形成和维持密切相关。NMDA受体是兴奋性氨基酸的特异性受体，参与体内各种信号传递和调节神经元的兴奋性。其中,含2B亚基的NMDA受体(NR2B)在伤害性感受的传递和调制、中枢可塑性形成中发挥重要作用。流行病学研究提示IBS的发病以女性多见。动物实验研究亦表明皮下注射雌激素增加大鼠的内脏敏感性。雌激素作用包括，通过雌激素受体的基因组效应，和通过膜受体的非基因组效应。雌激素对内脏高敏感影响主要是通过何种效应发挥作用尚不清楚。应激是IBS症状发生或加重的一个重要因素，雌激素影响着对应激的反应水平。雌激素是雌性大鼠急性束缚应激引起内脏敏感升高的必要因素。另外研究表明，避水应激，作为一种心理应激，可造成大鼠稳定、持续约30大的内脏高敏感。而雌激素是否影响慢性心理应激内脏高敏感形成，尚未见报道。为此，本课题以避水应激为模型，研究雌激素对内脏高敏感形成的影响，并通过雌激素受体拮抗剂ICI 182，780、NMDA受体竞争性拮抗剂AP5、NR2B选择性拮抗剂Ro25-6981进一步阐明雌激素作用机制。方法与结果 1、雌性大鼠内脏高敏感模型的建立及检测目的：我们首先观察避水应激是否引起正常雌性大鼠内脏高敏感形成，以明确定避水应激作为雌性大鼠内脏高敏感造模方法的可行性。方法：通过埋置腹壁电极记录20-40-60-80mmHg梯度压力结直肠扩张内脏运动反射(VMR)腹外斜肌收缩的肌电图，计算曲线下面积，以VMR幅度值来评价大鼠的内脏痛敏感性。将16只成年雌性大鼠随机分成2组，避水应激组(WAS)和假应激组(shamWAS)，分别予分别避水应激和假避水应激。连续应激10天，每天1小时。应激前，测VMR基础值；避水应激完成后，继续饲养4天，冉次测定后VMR幅度。开胸心室取血、以放射免疫法测定血浆CRF、ACTH的水平，灌注固定后取大脑用于c-fos免疫染色。比较WAS组和shamtWAS组大鼠VMR、血浆CRF和ACTH、杏仁核及室旁核c-Fos免疫阳性细胞(c-FLI)的差异。结果：WAS引起雌性大鼠内脏高敏感，应激大鼠结肠无病理学改变。大鼠经反复避水应激后，WAS大鼠血浆ACTH浓度(77．19±22．71)pg／ml，明显低于假应激组shamWAS的(148．71±50．37)pg／ml(P0．01)。WAS大鼠血浆CRF浓度35．41±22．71pg／ml，与假应激组shamWAS的(43．82±14．76)pg／ml无明显差异。WAS组大鼠室旁核c-FLI数24.33±4．93，与sham-WAS组22．14±3．82之间没有显著性差异(p0．05)。WAS组大鼠杏仁核c-FLI数25．64±5．39，明显多于sham-WAS组19．62±3．62(p0．05)。小结：WAS可作为雌性大鼠内脏高敏感造模方法。WAS后大鼠血浆ACTH水平降低，而CRF无变化。c-FLI数，在WAS大鼠杏仁核表达增加，而室旁核无变化。2、雌激素与内脏高敏感形成关系的研究目的：P2X_3受体在介导痛觉中发挥重要作用。本部分实验观察雌激素是否影响避水应激大鼠内脏高敏感的形成，以及P2X_3受体蛋白表达变化。方法：将卵巢切除后雌性大鼠32只随机分为侧脑室注射雌二醇(E2)后应激组(WAS+E2)、侧脑室注射E2后假应激组(shamWAS+E2)、侧脑室注射生理盐水后应激组(WAS+NS)、侧脑室注射生理盐水后假应激组(shamWAS+NS)。每次应激前30 min给予相应药物侧脑室注射，连续应激1O天，比较各组间应激前后内脏高敏感的变化。为进一步观察雌激素对内脏高敏感形成的影响，将WAS+E2、WAS+NS两组大鼠开胸心室取血用于CRF／ACTH放免测定，灌注固定取大脑c-fos免疫荧光染色，以及双侧腰1(L1)／骶1(s1)背根神经节(DRG)行P2X_3免疫荧光染色。比较WAS组和shamWAS组大鼠VMR、血浆CRF／ACTH、杏仁核及室旁核C-fos、DRG组织P2X_3表达的差异。结果：卵巢切除后大鼠，应激(WAS+NS)组与假应激(shamWAS+NS)组之间，内脏敏感性没有统计学差异。WAS+E2组内脏敏感性明显高于wAS+NS组，提示给予雌激素后，心理应激大鼠内脏敏感性升高。WAS+E2组大鼠山浆CRF浓度为(36．81±11．1)pg／ml，与WAS+NS的血浆CRF浓度(45．78±14．55)pg／ml，没有统计学差异。相似的，WAS+E2组大鼠血浆ACTH浓度为(77．81±17．20)pg／ml，与WAS+NS的血浆ACTH浓度(67．61±17．01)pg／ml，没有显著性差异。应激大鼠结直肠扩张后，杏仁核c-fos免疫阳性细胞数，WAS+E2组26．38±3．96明显多于WAS+NS组19．28±4．54(p0．01)；而室旁核C-fos免疫阳性细胞数，WAS+E2组26．12±5．74，与WAS+NS组22．43±3．87比较，两者之间没有统计学差异(p0．05)。应激大鼠DRG的P2X_3阳性细胞数占所有细胞数的比值，WAS+E2组(33．2±2．85)％明显多于WAS+NS组(38．38±3．31)％(p0．01) 小结：雌激素促进WAS大鼠内脏高敏感形成。雌激素不影响大鼠WAS后第4天血浆ACTH和CRF水平。雌激素增加WAS大鼠DRG的P2X_3受体表达。 3、雌激素对心理应激大鼠P2X_3、NR2B mRNA表达的影响目的：P2X_3受体在DRG中表达，NR2B在DRG和前扣带回(ACC)中均有表达。雌激素增加WAS大鼠内脏高敏感，本实验进一步明确雌激素是否影响应激大鼠DRG组织P2X_3 mRNA，以及DRG、ACC组织NR2B mRNA的表达。方法：将卵巢切除后雌性大鼠14只随机分为：侧脑室注射雌二醇后应激组(WAS+E2)、侧脑室注射生理盐水后应激组(WAS+NS)两组大鼠。连续侧脑室给药、应激10天。剪取大鼠腰1(L1)至骶2(S2)所有DRG以及前扣带回(ACC)组织，用real time PCR法比较DRG组织P2X_3、NR2B mRNA，以及ACC组织NR2BmRNA的水平。结果：WAS+E2组大鼠DRG的P2X_3 mRNA表达明显多于WAS+NS组大鼠(p0．05)。ACC组织NR2B mRNA，WAS+E2组高于WAS+NS组(p0．05)。而DRG组织NR2B mRNA，，WAS+E2组与WAS+NS组无显著性差异。小结：雌激素增加WAS大鼠ACC的NR2B mRNA，以及DRG的P2 X_3 mRNA表达，但对DRG的NR2B mRNA无影响。 4、雌激素核受体、NR2B拮抗剂对雌激素作用的影响目的：应用雌激素核受体拮抗剂ICI 182，780、NMDA受体竞争性拮抗剂AP5、NR2B选择性拮抗剂Ro25-6981，进一步阐明雌激素核受体、NR2B在雌激素促进心理应激内脏高敏感形成的作用。方法：将雌性大鼠32只卵巢切除后，随机分为侧脑室注射E2及ICI 182,780后应激组(WAS+E2+ICI)、侧脑室注射ICI 182，780后应激组(WAS+ICI)、侧脑室注射E2及Ro25-6981后应激组(WAS+E2+Ro)、侧脑室注射E2及AP5后应激组(WAS+E2+AP5)，连续侧脑室给药、应激1O天。各组与单用E2组(侧脑室注射E2后应激WAS+E2组)、对照组(侧脑室注射生理盐水后应激WAS+NS组)的VMR相比较。结果：与WAS+E2组比较，WAS+E2+ICI组只有在CRD 80mmHg压力降低VMR幅度(p0．05)。WAS+E2+ICI组大鼠，在CRD 60mmHg、80mmHg压力水平仍高于WAS+NS组大鼠的VMR幅度(p0．05)。WAS+E2+AP5组在60mmHg、80mmHg压力水平VMR幅度明显低于WAS+E2组大鼠。WAS+E2+Ro组在80mmHg压力水平VMR幅度低于WAS+E2组大鼠(p0．01)。小结：ICI 182，780阻断雌激素增加WAS大鼠内脏高敏感的一部分作用。联合应用AP5、Ro25-6981，阻断E2促进内脏高敏感形成的作用。NR2B是参与E2促进内脏高敏感形成的重要信号传导通路之一。 5、雌激素对大鼠急性结直肠扩张内脏痛的影响目的：NR2B参与雌激素促进慢性心理应激内脏高敏感的形成，阐述的足雌激素慢性或长期的作用。本部分实验分析雌激素的急性作用，观察单次侧脑室注射雌激素对大鼠急性结直肠扩张内脏痛的影响。方法：(1)不同剂量E2对内脏痛敏感性的影响：卵巢切除后雌性大鼠24只，随机分为侧脑室注射高剂量E2 10 ug(H-E2组)、侧脑室注射中剂量E2 1．0 ug(M-E2组)、侧脑室注射低剂量E2 O．1ug(L-E2组)、侧脑室注射对照NS(NS组)。分别比较注射30 min和4 h后的VMR幅度。(2)不同拮抗剂对中剂量E2作用的影响：卵巢切除后雌性大鼠24只，随机分为侧脑室注射E2 1．0 ug(E2组)、侧脑室注射E2 1．0 ug和ICI 182，780(E2+ICI组)、侧脑室注射E2 1．0 ug+Ro25-698(E2+Ro)、侧脑室注射E21．0 ug+AP5(E2+AP5)。比较各组药物侧脑室注射30 min和4 h后的VMR幅度。结果：(1)E2对非伤害性刺激20mmHg压力VMR肌电曲线下面积没有影响。E2剂量依赖性地增强CRD诱导的内脏伤害性刺激。高剂量组E2增加给药后30min的40mmHg(P0．05)、60mmHg(PO．01)、80mmHg(P0．05)压力VMR幅度。中剂量组E2增加给药后4h的40mmHg、60mmHg、80mmHg压力VMR幅度(均P0．05)，高剂量组E2增加给药后4h的40mmHg(PO．05)、60mmHg(P0．01)、80mmHg(PO．05)压力扩张VMR幅度。(2)ICI 182，780，AP5，Ro25-698，在侧脑室注射30 min和4 h后，一定程度地抑制E2增加内脏高敏感。其中，以AP5最为明显。小结：侧脑室注射雌激素增强大鼠急性结直肠扩张内脏痛敏感性，NR2B参与其调节作用机制。结论 1、反复避水应激可引起雌性大鼠内脏高敏感。 2、雌激素促进慢性心理应激大鼠内脏高敏感的形成。 3、雌激素增加慢性心理应激大鼠DRG的P2X_3受体以及ACC组织NR2B表达。 4、NR2B参与雌激素介导心理应激内脏高敏感的形成。 5、侧脑室注射雌激素增强急性结直肠扩张内脏痛敏感性，NR2B参与其调节作用。
【图文】：

室旁核

Sham-WAS组室旁核C-fosX200
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R574

【参考文献】