双歧杆菌CMS-H004株加重溃疡性结肠炎损伤的研究及其抗体的制备

发布时间：2020-04-09 09:05

【摘要】： 第一章：双歧杆菌CMS-H004株加重UC损伤的实验研究目的：在前期研究发现双歧杆菌CMS-H004株有加重UC损伤作用的基础上，用多株双歧杆菌比较的方法，验证是否CMS-H004株具有加重UC损伤的株特异性。方法： Balb／c小鼠70只，随机分为7组：1)正常组；2)模型组；3)阴性对照(NS组)；4)阳性对照(5-ASA组)；5)CMS-H004组；6)PFK组；7)JSQ组。5％DSS溶液自由饮用7天造成小鼠急性溃疡性结肠炎模型，通过观察、检测小鼠症状、体征、疾病活动度评分、病理组织学评分、电镜结构、结肠长度、肠道菌群分析、髓过氧化物酶活性、肿瘤坏死因子浓度等指标，评估双歧杆菌CMS-H004株与培菲康、金双歧中的双歧杆菌菌株对DSS诱导的UC的影响。结果：双歧杆菌CMS-H004株能够明显加重DSS诱导的UC模型损伤。其相当于人类UC的临床表现项目如：体重下降、隐血、血便及死亡时间等出现得最早，便血率、死亡率最高，疾病的DAI积分最高，粘膜损伤的病理学改变也最严重，结肠MPO活性最高，与其它各组比较有显著性差异(P＜0.05)。PFK、JSQ菌株以上各项损伤指标均没有DSS组严重。饮用DSS后肠道乳酸杆菌数目减少，拟杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌明显增加，肠球菌、双歧杆菌和总需氧菌无明显变化；CMS-H004组菌群变化与模型组相似，其双歧杆菌数目并未增加。结论： 1)在结肠粘膜有损伤的基础上，双歧杆菌CMS-H004株能够加重黏膜损伤； 2) DSS可使肠道乳酸杆菌减少，而不影响双歧杆菌数量；应用双歧杆菌CMS-H004株与其相似，但并不增加肠道双歧杆菌。第二章：双歧杆菌CMS-H004株加重UC损伤的机理研究目的：从炎症因子、紧密连接、防御素不同角度体内、体外初步探讨双歧杆菌CMS-H004株加重UC损伤的机理。方法： Balb／c小鼠45只，随机分为3大组、9小组：N3、N5、N7是正常组第3、5、7天：M3、M5、M7是DSS模型组饮用DSS后第3、5、7天；B3、B5、B7是CMS-H004菌株灌肠组饮用DSS后第3、5、7天。5％DSS溶液自由饮用7天造成小鼠急性溃疡性结肠炎模型。RT-PCR和免疫印迹法检测不同时间点结肠组织IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA和蛋白质水平的表达；免疫印迹法检测不同时间点结肠紧密连接蛋白ZO-1和β-防御素-2蛋白质的表达。体外培养HT-29细胞，与双歧杆菌CMS-H004株、PFK株共孵育1小时后用TNF-α刺激3小时，检测其上清LDH含量和NF-κB转录入细胞核的数目。结果： 1)饮用DSS诱导损伤后IL-1β、IL-6、TNF-α均开始有表达，但CMS-H004组在饮用DSS第3天后出现表达，而模型组是在饮用DSS第5天后出现，同一时间点CMS-H004组IL-1β、IL-6、TNF-α表达量高于模型组，正常组几乎不表达以上炎症因子。 2)正常组小鼠结肠高表达ZO-1蛋白，饮用DSS 7天后模型组和CMS-H004组ZO-1蛋白表达均低于正常组，模型组和CMS-H004组表达量无显著性差异。 3)正常组小鼠结肠几乎不表达BD-2蛋白，模型组和CMS-H004组在饮用DSS第5天后即有BD-2表达，但CMS-H004组BD-2表达量比模型组少。 4) TNF-α刺激HT-29细胞后各组培养液上清中LDH含量无显著性差异。 5) TNF-α体外刺激HT-29细胞后，除正常组外均均有NF-κB转录入核，其中CMS-H004组数目最多。结论： 1)双歧杆菌CMS-H004株能够促进炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α提前释放； 2)双歧杆菌CMS-H004株能够促进肠上皮细胞NF-κB转录入核； 3) DSS和CMS-H004株能破坏肠上皮细胞紧密连接、诱导β-防御素-2表达，可能不是CMS-H004株加重损伤的主要机制。第三章：CMS-H004菌株的分离、鉴定与相关研究目的：为后续可能的开发、临床研究及专利要求，进一步对CMS-H004专利菌株进行鉴定和相关研究，并将其保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。方法：通过光镜、电镜观察其形态学特征；通过生化反应、X-gal显色、代谢产物检测观察CMS-H004菌株生理、生化特征；通过(G+C)mol％测定、16SrRNA、质粒检测观察其遗传学特性；通过体外耐酸耐胆汁、抗生素敏感实验，研究其相关特性。结果： 1) CMS-H004株是革兰氏染色阳性杆菌，在MRS琼脂平皿上呈现圆形，白色，隆起，不透明，边缘整齐的湿润菌落。 2) CMS-H004株能利用葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖、麦芽糖、水杨素、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、七叶灵、甘油、纤维二糖、海藻糖、松三糖、棉子糖、山梨醇、鼠李糖，API 20A编码为：47757732。 3) CMS-H004株主要代谢产物是乙酸和乳酸，比值约为2.63：1，还可产生少量琥珀酸。 4) CMS-H004株(G+C)mol％为58.64％，无质粒。利用双歧杆菌特异性引物能够产生预期的扩增条带。 5) CMS-H004株体外能够耐酸、耐胆汁。 6)氯霉素、氧哌嗪青霉素、四环素、头孢孟多、先锋噻唑、米诺环素、阿奇霉素、利福平对CMS-H004株抑菌圈均大于10mm，庆大霉素抑菌圈为7.5mm左右，其余33种抗生素无明显抑菌圈。结论： 1) CMS-H004株是青春双歧杆菌的一株，已保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其典藏编号是：CCTCC M 206119。 2) CMS-H004株能够耐酸、耐胆汁，可以经过上消化道定植于肠道。 3) CMS-H004株对氯霉素、氧哌嗪青霉素、四环素、头孢孟多、先锋噻唑、米诺环素、阿奇霉素、利福平敏感，对庆大霉素中度敏感，，对其余33种抗生素耐药。第四章：双歧杆菌CMS-H004株抗体的制备与检测目的：制备双歧杆菌CMS-H004株的兔多克隆抗体。方法：提取CMS-H004株菌体蛋白，加入佐剂作为抗原常规免疫新西兰大白兔。达到一定效价后取血清，饱和硫酸铵沉淀法盐析、透析脱盐初步纯化兔IgG。用ELISA、免疫印迹和免疫培养的方法检测该抗体的最佳使用浓度、特异性、敏感性，并用此抗体检测UC患者与正常人粪便中的CMS-H004菌株。结果： 1)双歧杆菌CMS-H004株能刺激产生兔多克隆抗体，随着抗体浓度不断降低，与CMS-H004菌体蛋白反应也下降，在0.05μg/ml以下反应很弱且变化不大，选用0.5μg／ml为最佳使用浓度。 2)不同细菌与抗体(0.5μg／ml)反应，抗体与双歧杆菌CMS-H004菌体蛋白的反应最强，有显著性差异(P＜0.05)；双歧杆菌PFK、JSQ反应次之，而乳酸杆菌CMS-H001、CMS-H002及NS几乎无反应。 3)部分正常人(4／20)和部分溃疡性结肠炎患者(3／12)粪便中可见少量CMS-H004菌落生长，其余溃疡性结肠炎(9／12)患者粪便中可见大量菌落生长。结论： 1)双歧杆菌CMS-H004株能刺激新西兰大白兔产生抗体，抗体浓度、特异性、敏感性较好。 2)小样本检测显示双歧杆菌CMS-H004株存在于20％正常人和所有UC患者粪便中。
【图文】：

体重变化,小鼠,体重下降

中南大学博士学位论文第一章实验结果1、小鼠体重改变饮用DSS可以造成腹泻、便血等症状，会导致小鼠体重下降，症状越严重体重下降越多。实验前及饮用DSS前各组小鼠体重差异无显著性，正常组小鼠体重逐渐增加，而饮用DSS后，CMS一HO04组体重下降最早(饮用DSS第2天后就出现)、最多，与其余各组比较具有显著性差异(P<0.05)。模型组、NS组、5一ASA组、PFK组、JsQ组小鼠体重在饮用DSS后第4天均开始明显下降，与正常组比较均有显著性差异(P<0.05)，其中5一ASA组体重下降相对少。见图l一l。

血便,组结,平均长度,小鼠

肠内可见血便，以CMS一HO04组小鼠最为严重。而5一ASA组、PFK组、JsQ组结肠平均长度长于CMS一H004组、模型组和NS组，少量小鼠结肠内可见少量出血，大部分小鼠结肠内未见明显血便。见图1一2(A一G)。
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R574.62

【参考文献】