脂肪酸转位酶CD36负向调节肝细胞脂噬及分子机制研究

发布时间：2020-04-09 17:03

【摘要】：目的:非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD),目前世界上最常见的慢性肝病,是以肝脏组织内脂质异常蓄积为主要特征的代谢应激性肝损伤。脂噬,是细胞内选择性识别并降解脂质、产生游离脂肪酸、促进β氧化的自噬过程,是调控脂质代谢、防止脂质过度沉积的重要进程。抑制自噬削弱了肝内脂质降解,可显著增加肝细胞内甘油三酯含量,促进了肝脏脂肪变性的发生和发展。人类白细胞分化抗原36(cluster of differentiation 36,CD36),又称脂肪酸转位酶(fatty acid translocase,FAT),是一种长链脂肪酸的跨膜转运糖蛋白,参与脂质代谢;CD36也具有重要的细胞内信号转导调节作用,参与了脂肪酸储存和利用、糖代谢以及代谢性炎症等。近年来研究发现,CD36可通过AMPK信号通路影响脂肪酸β氧化,调节细胞内甘油三酯含量。然而,CD36与脂噬的关系未见报道。因此,本课题旨在探讨CD36是否调节肝细胞脂噬从而影响NAFLD的发展及可能的分子机制。方法:采用体重相近的6-8周龄C57BL/6J雄性小鼠,随机分组为普通饮食(normal chow diet,NCD)组和高脂饮食(high-fat diet,HFD)组,每组六只,分别用正常饮食和高脂饮食喂养14周,构建NAFLD小鼠模型。采用苏木精-伊红(haematoxylineosin,HE)染色,并检测肝脏组织内甘油三酯和游离脂肪酸含量。用western blotting法检测肝脏组织CD36、LC3Ⅱ、p62的蛋白表达水平。分别转染小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)于HepG2和Huh7细胞中以敲降CD36表达或用慢病毒构建CD36过表达稳定细胞系,western blotting、单丹磺酰尸胺(MDC)染色和免疫荧光法观察CD36表达改变后的自噬水平。自噬抑制剂氯喹处理肝细胞或转染自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)后,检测CD36表达对自噬流的影响。采用6-8周龄C57BL/6J背景的野生型(wild type,WT)小鼠和CD36基因敲除(CD36 knockout,CD36-/-)小鼠,分别随机分组为NCD组和HFD组,每组六只,分别用正常饮食和高脂饮食喂养14周,检测肝脏组织自噬。采用6-8周龄CD36-/-小鼠,分别经尾静脉注射GV341慢病毒空载体或携带CD36基因的GV341慢病毒,且保持高脂饮食喂养8周后,用透射电子显微镜观察肝脏组织自噬囊泡的变化。沉默CD36后,采用LC3蛋白或溶酶体与脂滴共定位的方法观察肝细胞脂噬的变化,酶法检测甘油三酯含量,线粒体压力测试试验检测氧耗速率,并用western blotting法和定量PCR(qPCR)法检测肉毒碱棕榈酰基转移酶1A(carnitine palmitoyltransferase 1a,CPT1a)的表达。western blotting法检测肝细胞和肝组织内CD36表达下调后AMPK激活的变化,用AMPK抑制剂Compound C处理后检测肝细胞自噬的改变,bodipy染色观察脂质含量的变化。qPCR筛选主要自噬相关基因,western blotting法检测ULK1、Beclin1总蛋白及磷酸化水平。结果:与NCD组相比,HFD组小鼠肝脏脂肪变性明显,肝组织甘油三酯和游离脂肪酸含量明显升高。HFD组小鼠肝脏组织CD36表达明显升高,LC3Ⅱ表达下降,p62表达升高。在HepG2和Huh7细胞中,敲降CD36表达后自噬升高;而过表达CD36后自噬下降。通过氯喹处理细胞和自噬双标腺病毒转染实验,证实CD36表达下降促进了自噬流。体内实验中,小鼠CD36的缺失明显增强了肝脏组织内自噬;而在CD36-/-小鼠中,CD36表达的重建降低了肝脏组织自噬。肝细胞CD36的敲降增强了脂噬,促进了β氧化,降低了TG含量,上调了CPT1a的表达,而抑制自噬后,脂噬和β氧化减弱。CD36表达的下调促进了肝细胞或肝脏组织中AMPK的激活,而抑制AMPK后,自噬再次下降,脂质含量再次增多。肝细胞CD36的敲降增强了ULK1、p-ULK1(Ser555)、Beclin1、p-Beclin1(Ser93)的蛋白水平,降低了FOXO1的表达,增强了p-FOXO1水平,而mTOR、p-mTOR、ATG7水平无明显改变。抑制AMPK后,ULK1和p-ULK1(Ser555)水平下降。结论:在体内外实验中,CD36的表达负向调节自噬。肝细胞CD36的敲降,通过AMPK-ULK1/Beclin1途径,增强了脂噬及脂肪酸β氧化,减轻了脂质累积。这提示我们,降低CD36的表达除了可减少脂肪酸摄取以外,还可通过诱导脂噬来增强脂肪酸的清除,这可能成为治疗脂肪肝疾病和其他代谢性疾病的潜在策略。
【图文】：

厚度的超薄切片，，用醋酸铀和枸缘酸铅染色。3)上机：用透射电镜观察，拍照，保存。1.2.16 统计学分析采用 GrapphPad Prism5 软件对数据进行统计分析并绘图，实验结果用均值 标准差表示，组间比较以方差分析、独立样本 t 检验进行两两比较，P< 0.05 被认为具有显著性统计学差异。2 结果2.1 高脂饮食下小鼠体重增长明显每周称量小鼠体重，结果显示，HFD 组小鼠体重及体重的增长明显高于 NCD组小鼠（图 1-1）。

图 1-2 正常饮食和高脂饮食下小鼠肝组织脂质含量igure 1-2 The lipid content in liver tissue of mice fed with NCD and HFD观察小鼠肝组织脂质沉积情况；B: 检测小鼠肝组织 TG 和 FFA 含量。n=6以均值±标准差表示，*表示与 NCD 组比较，P<0.05。id accumulation in liver tissue of mice were evaluated by HE staining; B: Thntents in mouse livers were detected. n=6, data were presented as the mean*represents p<0.05 vs. NCD groups.食下小鼠肝脏组织 CD36 表达增加，自噬水平下降rn blotting 检测结果发现，HFD 组小鼠肝脏组织 CD36 表达水平显 LC3Ⅱ水平显著低于 NCD 组，p62 蛋白水平明显高于 NCD 组（图
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575

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本文编号：2621024