乙型脑炎病毒分子流行病学、诊断及重组疫苗研究

发布时间：2020-04-14 09:47

【摘要】：流行性乙型脑炎病毒（JEV）主要由三带喙库蚊传播的自然疫源性疾病，猪群是JEV储存宿主，在乙型脑炎的流行中起重要作用。JE在亚洲地区普遍流行，每年约3-5万人感染，死亡1-1.5万人。乙脑病毒同样也给养猪行业，尤其是我国西南地区畜牧业原本不发达地区造成重大的经济损失，母猪感染病毒后可出现流产、仔猪发育不良或木乃伊胎等症状。 云南省景洪市位于中缅边境，属于虫媒病毒病流行的主要地区，因此在该地区开展虫媒病毒调查尤其是乙型脑炎病毒的分子流行病学研究有重大意义。本研究对云南景洪地区蚊虫和猪脑组织样品进行JEV分子流行病学调查，用常规PCR方法检测430份蚊虫样品和108份猪脑组织样品扩增JEV Ⅰ和JEV Ⅲ保守区NS1非结构蛋白基因，结果发现蚊虫样品中C. tritaeniorhynchus（三带喙库蚊）JEV感染率为13.2%（57/430）， A. sinensis（中华按蚊）为2.7%（3/430），A. subalbatus（骚扰阿蚊）0.7%（3/430），，仔猪脑组织样品阳性率为18.5%（20/108）。并从阳性样品扩增JEV结构蛋白基因E，结果从C.tritaeniorhynchus、A. sinensis和猪样品中分别得到8份、5份和3份阳性结果。对这16份样品进行序列分析发现与基因Ⅲ型JEV序列相似率最高为99.7%。未检测出基因Ⅰ型JEV。可以推测基因Ⅲ型JEV是云南地区主要流行基因型。我们又用云南省寄生虫防治所提供的人和猪JEV E基因序列进行进一步对比分析。结果发现云南省蚊源中（Cx.tritaeniorhynchus6个、A n.sinensis4个）JEV序列分别与人源JEV序列完全相同，而猪源JEV与人源JEV序列相似率为96.2%-98.6%，亲缘关系比较接近。 本次流行病学调查成功从猪脑组织和蚊虫样品中成功分离出2株JEV病毒Yunnan0901和Yunnan0902株（GenBank accession numbers JQ086762和JQ086763）。获得2株JEV Ⅲ全基因序列，并与以前在其它地区和时间分离的JEV全基因进行对比分析。其中Yunnan0901株和Yunnan0902株5’-NCR端均有1个碱基发生置换，置换率均为1.05%而氨基酸均未发生改变。结构蛋白基因中Capsid基因分别有2和1个碱基发生置换，置换率分别为0.52%和0.26%Yunnan0901株氨基酸未发生改变而Yunnan0902株则有1个氨基酸发生改变。Membrane基因分别有3和1个碱基发生置换，置换率分别为0.59和0.20%，Yunnan0902株氨基酸未发生改变而Yunnan0901株则有1个氨基酸发生改变。Envelope基因分别有10个和4个碱基发生置换，置换率分别为0.67%和0.27%Yunnan0901株有9个、Yunnan0902株有3个氨基酸发生改变， NS5基因分别有25个和16个碱基发生置换，置换率为0.91%和0.59%其中Yunnan0901株有18个、Yunnan0902株有9个氨基酸改变。3’-NCR端碱基均未改变。该结果说明猪是病毒的储存宿主而且容易引起病毒的变异。将Yunnan0901和Yunnan0902分离株的E基因与93株JEV E基因进行对比，为JEV的基因进化提供依据。 由于乙脑病毒的分离只有在病毒血症时期的外周血中可分离到。目前最常用的猪JEV诊断是用ELISA方法，检查血液或脑脊液中抗体。但是血清学方法在检查JEV时会与其他病毒有较大的交叉反应。常用的猪乙型脑炎病毒检测主要是RT-PCR和real-time PCR方法，而这两种方法虽然检测较灵敏但是需要昂贵的设备和有经验的操作人员。而近些年LAMP检测方法依靠高灵敏性、准确性、简便性等特点被广泛应用于基础检测机构。 因此，我们以此为出发点研发一种简便快速准确的用于现场和基层监测部门的猪乙型脑炎诊断方法。根据JEVⅠ（K94PO5）和JEV Ⅲ（SA14-14-2）株设计LAMP扩增引物。优化反应体系结果发现LAMP与real-time PCR灵敏性和准确性基本相似，但是LAMP更加节省时间而且对仪器设备的要求较低，扩增过程仅需要一个恒温水浴锅即可。LAMP与常规PCR相比其优势更加明显，不仅节省时间而且其灵敏度是常规PCR的100倍。样品检测LAMP检测结果与病毒分离方法完全一致。 在疫苗研究方面目前尚未有专门用于猪的乙型脑炎病毒疫苗，都是用人用的弱毒疫苗SA14-14-2株来代替免疫。虽然免疫效果较好但是SA14株存在毒力返强的趋势免疫后可能引起动物发病，所以我们有必要研发一种兽用新型乙型脑炎病毒疫苗。E蛋白抗原可诱导产生病毒中和抗体和CTLs效应，用该抗原生产的疫苗可以区分野毒感染还是疫苗株毒力返强而引起动物发病。 痘苗病毒基因组较大，可插入大量外源基因，而且非必须基因多删除后不影响病毒的复制和功能。本研究构建了的乙型脑炎重组痘苗病毒疫苗含有乙型脑炎病毒E抗原，而且敲除了痘苗病毒TK和E3L基因使病毒达到致弱的目的。我们将乙脑病毒E基因插入到复制缺失型（E3L）的痘苗病毒基因组中并成功表达。经过Western blot分析E蛋白成功表达。而且表达的E蛋白产物有生物学功能。重组痘苗病毒可诱导乙脑病毒特异性T淋巴细胞反应，肌肉免疫小鼠和猪实验发现其产生的抗体水平也高于弱毒疫苗和其他免疫组（P 0.05）。猪中和抗体实验也进一步证明这一结果。小鼠淋巴细胞增殖实验证明JEV特异性刺激结果免疫组间SI指数，2次重组痘苗病毒免疫组（1.86）弱毒疫苗免疫组（1.59）1次重组痘苗病毒免疫组（1.37）痘苗病毒缺失免疫组（1.21）PBS免疫组（1.01）。猪淋巴细胞增殖实验结果2次重组痘苗病毒疫组（1.65）弱毒疫苗免疫组（1.45）1次重组痘苗病毒免疫组（1.29）痘苗病毒缺失免疫组（1.16）PBS组（1.02）。小鼠和猪JEV的刺激其结果说明，重组痘苗病毒免疫组刺激指数（SI）显著高于其他组（P 0.05）证明其可有效激发机体产生细胞免疫，提高了机体细胞免疫应答。 细胞免疫应答是抵抗乙脑病毒感染的重要保护性免疫。IL-4和IL-10是评价Th2类细胞分化的重要指标。IFN-γ和IL-2，一般被认为是Th1类细胞因子，同样可诱导Th2类细胞的产生。我们从小鼠免疫实验IFN-γ结果，2次重组痘苗病毒疫组（1207）弱毒疫苗免疫组（870）1次重组痘苗病毒免疫组（688）痘苗病毒缺失免疫组（367）PBS组（197）。IL-4结果，2次重组痘苗病毒疫组（728）弱毒疫苗免疫组（603）1次重组痘苗病毒免疫组（460）痘苗病毒缺失免疫组（230）PBS（117）。重组痘苗病毒免疫组各细胞因子水平显著高于PBS对照组（p0.05）。 猪免疫试验IFN-γ结果，2次重组痘苗病毒免疫组（1078）弱毒疫苗免疫组（866）1次重组痘苗病毒免疫组（778）痘苗病毒缺失免疫组（474）PBS组（329）。IL-4结果，2次重组痘苗病毒免疫组（469）弱毒疫苗免疫组（393）1次重组痘苗病毒免疫组（320）痘苗病毒缺失免疫组（221）PBS免疫组（107）。重组痘苗病毒免疫组各细胞因子水平显著高于PBS对照组（p0.05）。 以上结果表明，重组痘苗病毒疫苗免疫小鼠和猪后可激发机体产生的体液和细胞免疫应答。小鼠和猪的攻毒保护试验证明，重组痘苗病毒疫苗对小鼠（5/5）和猪（5/5）均有很好的保护效力这一结果显著高于弱毒疫苗免疫组和其他对照组。而且与其他免疫组相比明显降低猪病毒血症的发生临床症状明显减小，因此我们所研发的新型重组痘苗病毒乙型脑炎疫苗的安全性、有效性和制作简单等特点有望成为现有乙脑病毒疫苗替代品。
【图文】：

图 1.1 中国云南省景洪地区蚊虫采集区域ure 1.1 Map of Jing Hong in Yunnan Province， where the samples were coll胞、 菌种和克隆载体-21 细胞由中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究病毒室保存，大受态菌购自 TaKaRa 公司，克隆载体 pMD18-T 购自大连 TaKaRa 公司。胞培养试剂M 细胞培养液、标准胎牛血清、双抗购自 HyClone 公司；RNA 提取试司。JEV 阳性抗体本实验室保存；其他化学试剂均为分析纯由本实验室具酶及化学试剂 提取试剂盒购自 TaKaRa 公司，M-MLV 反转录酶为 Promega 公司产品酶、DNA Marker 均购于 Takara 公司，分子量标准 DL2000 大连宝生物公司产品、其他化学试剂均为分析纯由本实验室提供。要仪器和耗材le 公司高速低温离心机和常温离心机，Pharmacia 公司 DNA/RNA公司-70℃超低温冰箱，天能公司的 GIS 凝胶成像系统，Bio-Rad 公司水

图1.2 JEV Ⅲ和JEVⅠ NS1 及E基因的RT-PCR扩增plified products of JEV Ⅲ NS1 gene (A)and JEVⅠE gene(B)by RT-PCR fr M：DL2000 DNA Marker;1-2. The PCR product of gene NS1; 3:The PCR Encephalitis virus as positive control ;4: Negative control表1.10 2009-2010年景洪地区检测的蚊虫和猪脑样品JEV阳性率V E基因的PCR扩增结果thNo Mosquito 和swine testedNo.（%） Mosquito 和 swine posiMosquito(50/tube)SwinebrainCx.tritaeniorhynchus An.sinensis Ar.subalbat75 15 9（12） 3（4.0） 0 66 20 12（18） 4（6.0） 2（3.0） 65 10 10（15） 2（3.0） 1（1.5）82 21 8（9.7） 1（1.2） 0 74 25 10（13.5） 2（2.7） 0 68 17 8（11.7） 0 0 430 108 57（13.2） 12（2.7） 3（0.7）
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R512.62;Q78

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 项秉懿;陈苏民;;乙型脑炎病毒的分子生物学研究进展[J];中国病毒学;1993年03期

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1 杨耀武;流行性乙型脑炎病毒E蛋白基因主要抗原域的原核表达及ELISA诊断试剂盒的研制[D];沈阳农业大学;2003年

2 孙圣福;日本乙型脑炎实验室诊断方法的研究和应用[D];华中农业大学;2004年

本文编号：2627168