uMSC外泌体治疗肝纤维化的糖基化修饰相关机制及其转化应用的关键技术研究

发布时间：2020-04-15 16:17

【摘要】：研究背景与目的:干细胞(Stem cell)由于具备无限的增殖和分化潜能,近几年逐步被用于临床转化研究当中。人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,uMSC)由于具有容易获取、免疫原性低、增殖能力强等优点,成为了目前干细胞研究的焦点~([1])。而uMSC分泌的外泌体也自然成为了我们研究的核心之一。外泌体(Exosome)是细胞分泌的一种小囊泡,具有脂质双分子层结构,直径一般在30-150nm之间。从刚开始被发现到现在,外泌体的功能逐步引发人们的关注。有很多研究报道,外泌体可以装载一些生物信号分子,参与细胞间通讯~([2])。但大部分有关于外泌体的研究,研究焦点多集中在lncRNA、microRNA等小分子物质上,而对其所含的蛋白质关注较少~([3-5])。在真核生物的蛋白质中,超过20%都是经过糖基化修饰的糖蛋白(Glycoproteins)~([6])。它们通常会参与很多生物学过程,发挥很多作用,如细胞与细胞的识别、信号传导和细胞粘附等等。糖链结构的错综复杂导致了糖蛋白结构的复杂性与多变性。与DNA转录不同,蛋白质的糖基化修饰没有相应的模版,而是依靠酶促反应将单糖或多聚糖共价连接到蛋白质骨架上的,这便赋予了糖蛋白的多样性和异质性~([7,8])。并且糖蛋白的分类也和糖链有关,依据糖链与蛋白连接位点的不同,分为N糖基化蛋白、O糖基化蛋白和C糖糖基化蛋白等。位于细胞表面的糖蛋白能促进细胞之间的相互识别、信号的传递和细胞与细胞的粘附~([9,10])。而外泌体作为细胞间的通讯方式,同样也会涉及细胞与外泌体之间的相互识别,并且,有研究报道外泌体能够治疗一些疾病~([11]),我们课题组前期研究也发现,在小鼠四氯化碳肝损伤模型中,uMSC外泌体能够降低血清I型胶原和透明质酸等肝损伤指标,促进肝损伤修复,但其机制仍不是特别清楚,那么外泌体中的糖蛋白在外泌体通讯中发挥了怎样的作用,这些糖蛋白对于外泌体治疗疾病又有怎样的作用,我们是否能过调节外泌体表面的糖基化修饰来使外泌体变得更稳定并改善外泌体与靶细胞的相互作,从而使外泌体治疗疾病的效果得到进一步提升,这些都值得我们研究。肝纤维化(Hepatic fibrosis)是慢性肝脏病发展成为肝硬化的一个过渡阶段~([12])。其病理机制主要包含两个方面:正常肝细胞的凋亡和肝星状细胞的激活。近些年对于肝纤维化的治疗,仍没有特别有效的方法,常规的药物治疗如肾素-血管紧张肽转化酶抑制药、TGF相关因子拮抗药和干扰素(interferon,INF)等,均只能起到缓解病情进展的作用,而最有效的治疗方法--肝移植,却面临供体来源匮乏的难题。根据研究报道,外泌体可以用于临床治疗,促进一些疾病的康复,糖基化修饰可以用于加强药物疗效~([13]),那么uMSC外泌体中的糖基化修饰是否能促进外泌体治疗疾病,对糖基化修饰进行改造后的uMSC外泌体对肝纤维化治疗是否也能起作用。这是我们研究的重点。外泌体的临床应用还可以通过基因工程技术进一步改进和优化。CRISPR-Cas9基因编辑技术可以容易精准的对多种生物进行基因修改,有广阔的应用空间,在外泌体未来临床应用中也可能有重要作用。CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)即成簇规律间隔短回文重复,是细菌基因组中的一段DNA序列,Cas(CRISPR associated)即CRISPR相关基因,该基因有多种类型,Cas9只是其中一种~([14])。CRISPR-Cas9系统是细菌体内的一种获得性免疫系统,专门应对外源入侵的DNA并将其切断。后来被人们用于精准的基因编辑,其效果优于传统的基因编辑方法。我们的前期研究,利用CRISPR-Cas9技术敲除细胞内糖基转移酶的过程中,发现外源导入Cas9的细胞其增殖速度会变快。其机制仍不清楚。通常情况下,外源导入的Cas9载体会在细胞内转录成mRNA,那么,Cas9的mRNA作为外源的核酸物质进入细胞,会不会影响细胞内环境,从而影响该技术的安全应用,就成为我们提出并关注的核心问题。ceRNA机制在细胞的生物循环代谢中普遍存在,该机制机制认为,microRNA可以通过与信使RNA结合引起基因表达降低,而ceRNA可以通过microRNA上的应答元件(microRNA response elements,MREs)反过来竞争性结合microRNA,导致基因表达增加~([15])。有文献报道,mRNA因其表达量较高,也可以在细胞内充当ceRNA的角色,调控基因的表达~([16])。因此,Cas9的mRNA也可能会与细胞中某些重要的microRNA产生相互作用,影响细胞内整个RNA相互作用网络,从而影响到细胞的生物学行为,甚至对Cas9应用的安全性产生隐患。利用优化后CRISPR-Cas9技术对细胞进行基因编辑,可能更有利于其分泌的外泌体发挥促进肝纤维化修复的作用,同时提高外泌体应用的安全性。本课题的目的在于研究uMSC外泌体糖基化对肝纤维化修复作用的影响,探索糖基化修饰外泌体治疗肝纤维化的作用及其机制。应用CRISPR-Cas9技术的同时,从ceRNA机制角度出发,提出对该技术安全性方面的思考,并且找到优化Cas9的方法。为外泌体和CRISPR-Cas9技术的临床转化应用奠定一定基础。也为外泌体的优化和安全应用提供了一定理论依据。第一部分uMSC外泌体治疗肝纤维化的糖基化修饰相关机制研究方法:1.通过超速离心方法收集人脐带间充质干细胞(uMSC)外泌体,人骨髓间充质干细胞(bMSC),人肝癌细胞(HepG2),和人胚肾细胞(293T)四种细胞的外泌体,然后通过Western blot实验、qNano检测和透射电镜检测三种检测方法确定我们提取的外泌体是否合格,能否能够用于后续实验研究。2.在肝损伤的细胞模型中,检测uMSC外泌体对肝损伤有一定修复作用。用双氧水诱导肝细胞凋亡,再加入外泌体,通过凋亡试剂盒和流式细胞仪检测,确定外泌体是否能抑制细胞的凋亡。此外,通过外泌体处理细胞,与肝细胞的共培养,然后Edu检测细胞增殖。用TGF-β1使肝星状细胞激活,同时加入外泌体共培养,qPCR和Western blot检测肝星状细胞α-SMA的表达情况,确定外泌体对星状细胞活化的影响。3.通过CM-Dil对外泌体染色,确定外泌体发挥作用时在细胞内的定位。同时对4种来源于不同细胞上清的外泌体进行凝集素芯片检测,通过对比发现差异丰度的糖结构。再通过凝集素印迹进一步证明芯片检测的结果可用准确可靠。最后,通过qPCR检测4种细胞中催化形成特异性糖结构的糖基转移酶其表达水平的差异。4.通过外源唾液酸酶的作用切除外泌体中糖蛋白特异性的糖结构,凝集素印迹实验验证是否糖苷酶成功切除了外泌体的糖结构。然后流式检测凋亡和qPCR实验,比较糖结构切除和未切的外泌体,两者对肝细胞凋亡和肝星状细胞活化的影响。5.通过CRISPR/Cas9技术在基因层面去除特异性的糖基转移酶,研究其催化产生的特异性的糖结构对外泌体功能的影响。构建了针对α-2,6-唾液酸糖基转移酶的gRNA质粒,并和Cas9载体共同转染到细胞中,细胞基因组PCR验证是否成功切断。结果:1.Western blot实验结果证明我们超离提取的外泌体能表达特异标志CD63和CD9。另外,qNano纳米生物颗粒分析仪的结果表明我们提取的外泌体粒径分布为118.3±37.8nm,浓度为9.67x10~100 particles/ml。最后,透射电镜的结果观察到外泌体呈类圆形,大小约50-100nm之间。以上结果说明我们提取的外泌体质量合格。2.首先,从流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞ROS的结果可以看出,双氧水能成功诱导人正常肝细胞(L02和WRL68)的凋亡和ROS水平的升高。而加外泌体处理后,细胞的凋亡减少。Edu检测结果证明,外泌体对细胞的增殖有促进作用。Western blot和qPCR的实验发现,外泌体对于TGF-β1引起的LX2激活有抑制作用,并且降低α-SMA表达。3.免疫荧光实验结果,观察到uMSC分泌的外泌体能够进入肝细胞内部。凝集素芯片的结果发现,uMSC外泌体SNA和ConA的结合率显著高于对照组。凝集素印迹的结果与凝集素芯片检测的结果基本相同。而qPCR的结果发现8种催化产生α-2,6-唾液酸糖结构的酶中,ST6Gal-2的表达在uMSC中最高。4.酶切后的外泌体,通过凝集素印迹的实验结果,可以确定唾液酸酶能够成功切除α-2,6-唾液酸糖结构。而切除了该糖结构的外泌体,通过细胞凋亡检测和qPCR的结果发现,外泌体抑制肝细胞凋亡及星状细胞活化的效果减弱。5.利用实验室现有载体,成功构建了针对人ST6Gal-2基因2号外显子的gRNA质粒。在细胞中转染了Cas9和gRNA质粒后,细胞基因组抽提后PCR结果证明,成功切断ST6Gal-2基因。结论:通过实验可以看出,uMSC外泌体对肝纤维化的恢复有促进作用,其既能抑制肝细胞的凋亡,还能促进肝细胞增殖同时抑制肝星状细胞的活化。通过凝集素芯片检测发现,外泌体治疗肝纤维化其机制可能是通过所含有的糖蛋白发挥作用。而外泌体的功能可能与糖蛋白中的α-2,6-唾液酸关系密切。我们也许能通过调整改变糖基化修饰,提高外泌体的临床治疗效果。第二部分CRISPR/Cas9技术安全性研究及改良方法探索在第一部分中,我们利用CRISPR/Cas9技术敲除糖苷转移酶时,发现转染了Cas9的细胞增殖会加快,这提示我们,对于外泌体临床应用和基因编辑技术的安全性需要进一步探索和优化。方法:1.通过Miranda软件预测Cas9 mRNA是否存在与microRNA的相互作用的可能。然后通过细胞转染,将miRNA转入稳定表达Cas9蛋白的细胞系HEK293-Cas9中,进一步通过qPCR和Western blot检测miRNA对Cas9表达的影响。另一方面,通过生物信息学分析,了解掌握转染Cas9后miRNA下游基因的富集情况。在不同肿瘤细胞系(Du145、U251、SH-SY5Y)中转染Cas9病毒,通过qPCR和Western检测miRNA下游基因的表达变化情况。2.基于上一步的预测结果,发现Cas9 mRNA可能与MicroRNA-let7结合,而let7属于一类抑癌的miRNA。因此,我们在肿瘤细胞系Du145转染Cas9慢病毒,通过CCK8实验,Ki-67细胞免疫荧光检测和PI染色细胞周期检测,观察外源导入的Cas9对肿瘤细胞增殖的影响。进一步,通过体内实验,在裸鼠皮下荷瘤,比较转染Cas9的肿瘤细胞与对照组细胞成瘤能力有无差别。3.同样,我们在正常细胞中也转染Cas9载体,通过qPCR和Western blot检测let7下游基因表达变化。Cas9对细胞增殖的影响则通过Edu和克隆形成实验来检测。此外,我们将bMSC转染Cas9的细胞进行高通量转录组测序,通过GSEA分析和GO分析,进行下游机制研究。最后,我们还利用Cas9转基因小鼠,通过其组织蛋白的Western blot实验和组织切片的免疫组化实验,分析let7下游靶基因表达变化。4.通过构建Cas9 mRNA的同义突变体Cas9-mut,对可能存在的ceRNA机制进行验证。在癌细胞中转染Cas9、Cas9-mut和对照载体,通过细胞克隆形成、CCK8和细胞周期实验,检测Cas9-mut对细胞增殖能力的影响,与Cas9组相比有无变化。5.通过构建针对EGFP的gRNA,将其与Cas9-mut同时转染到稳定表达EGFP的HEK293细胞中,荧光显微镜观察结果,确定Cas9-mut是否仍有基因编辑作用。结果:1.Miranda预测发现Cas9 mRNA存在能与microRNA-let7结合的碱基序列。将mimic-let7和mimic-NC转染到HEK293-Cas9细胞后,qPCR和Western blot的结果显示,Cas9的表达降低。生物信息学分析显示,过表达Cas9后let7下游基因出现更多正向富集。不同肿瘤细胞系中转染Cas9后qPCR和Western blot的结果显示,部分let7下游基因表达上调。2.Du145细胞中转染Cas9后,CCK8实验、Ki-67细胞免疫荧光检测和PI染色细胞周期检测的结果均发现,Cas9能促进细胞的增殖。而且裸鼠荷瘤的实验发现,Cas9能增加肿瘤细胞Du145的成瘤能力。3.在Hacat和bMSC细胞中转染Cas9后,通过qPCR和Western blot检测,发现部分let7下游基因表达上调。Edu和克隆形成证明Cas9对Hacat细胞的增殖也有促进作用。进一步将bMSC转染Cas9的细胞进行高通量转录组测序,分析发现let7下游基因在转染Cas9的细胞中更多的呈现正向富集。GO分析结果显示差异表达基因在RAS通路上富集。Cas9转基因小鼠的Western blot实验和免疫组织实验,均显示部分let7下游基因表达上调。4.HepG2中转染Cas9、Cas9-mut和对照载体后,CCK8实验结果显示Cas9能促进细胞增殖,但Cas9-mut与对照组无差异。Du145细胞中,同样转染三种载体,克隆形成实验和细胞周期实验的结果均显示Cas9-mut和Cas9均能促进细胞克隆的形成和细胞增殖,但突变体Cas9-mut的促进作用弱于Cas9本身。Western blot的结果显示Cas9-mut能促进let7下游基因FN1和Kras的表达,其促进作用弱于Cas9。5.在HEK392-EGFP细胞中,转染了Cas9-mut和EGFP-gRNA后,观察到细胞群中出现EGFP阴性细胞。因此一定程度上说明Cas9-mut仍然具有基因编辑的功能。结论:Cas9 mRNA可能通过ceRNA机制与microRNA-let7结合,两者在细胞中会相互影响。在某些本底表达let-7的肿瘤细胞和正常细胞中,外源导入的Cas9会促进细胞的增殖,其机制可能是通过吸附let7,使let7下游的癌基因表达上调。同义突变的Cas9-mut,能够减少这种促进增殖的效应,并且仍有基因编辑作用,是Cas9序列的优化,有利于CRISPR-Cas9技术的进一步发展。将优化后的Cas9-mut用于外泌体的改造,也会更有利于外泌体的临床转化应用。小结:干细胞外泌体和CRISPR-Cas9技术在医学研究中都具有巨大的发展潜力并且均有可能运用于临床治疗。我们发现uMSC的外泌体对逆转肝纤维化具有积极作用,其机制是通过抑制星状细胞的活化和肝细胞的凋亡,并促进正常肝细胞的增殖。这个过程中,外泌体含有的α-2,6-唾液酸糖基化修饰起了关键作用。另一方面,外源导入的Cas9可能与细胞内的microRNA-let7相互结合,从而引起细胞增殖和癌基因表达。优化后的Cas9-mut能使这种“副作用”减弱。采用优化的基因编辑技术对细胞进行改造,从而实现对外泌体糖基化修饰的进一步优化,更有利于提高外泌体临床应用的安全性。
【图文】：

鉴定结果,表面标志,跨膜蛋白,超速离心

加入适量用抗体稀释液稀释好的一抗，再用 PBS 清洗 3 次，每次 3 分钟。然后小时。时间到后，吸去二抗，同样 PBS 洗钟（此步骤也可省略）。最后荧光显微镜体有特异性的表面标志物，跨膜蛋白 CD6验确定我们超离提取的细胞上清外泌体能ano 仪器检测外泌体，发现其粒径分布为（图 1-2）。此外，我们还通过透射电镜，观3）。以上实验均说明我们通过超速离心提取的实验研究。

间充质干细胞,脐带,大小分布,检测结果

体有特异性的表面标志物，，跨膜蛋白 CD63验确定我们超离提取的细胞上清外泌体能表Nano 仪器检测外泌体，发现其粒径分布为 1l（图 1-2）。此外，我们还通过透射电镜，观-3）。以上实验均说明我们通过超速离心提取的实验研究。1 不同类型细胞上清提取的外泌体 Westernblot 鉴
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.2

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