【摘要】：第一部分酪酸梭菌调控上皮-间质转化对实验性结肠炎的影响目的:从上皮-间质转化角度,探讨不同浓度酪酸梭菌活菌对小鼠硫酸葡聚糖(dextran sodium sulfate,DSS)实验性结肠炎的影响。材料与方法:50只雄性C57B/6小鼠随机分为5组,每组10只,即1)正常对照组2)DSS模型组3)低剂量酪酸梭菌活菌处理组4)中剂量酪酸梭菌活菌处理组5)高剂量酪酸梭菌活菌处理组。除正常对照组小鼠外,其余小鼠每日自由饮用3.5%DSS溶液,共7天,建立DSS结肠炎小鼠模型;在结肠炎造模开始前7天,除正常对照组、模型组小鼠外,其余小鼠分别给予107CFU/ml、108CFU/ml、109CFU/ml酪酸梭菌活菌0.2ml灌胃,以建立低剂量、中剂量、高剂量酪酸梭菌活菌干预模型,并从以下两个方面进行评估(1)小鼠结肠炎症程度:结肠炎造模开始后,每日记录各组小鼠疾病活动指数;造模结束后,测量小鼠结肠长度,计算结肠组织炎症损伤评分,ELISA法检测血清TNF-α含量。(2)小鼠结肠组织上皮-间质转化:qRT-PCR法检测各组小鼠结肠组织中E-cadherin mRNA、Vimentin mRNA表达量;免疫组化方法半定量测定结肠组织中E-cadherin、Vimentin蛋白表达。数据分析采用SPSS20.0统计分析软件进行统计学处理,定量资料用means ± standard deviation(SD)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,P0.05为有统计学差异。结果:自由饮用3.5%DSS溶液7天能成功建立DSS结肠炎小鼠模型。除1只高剂量酪酸梭菌活菌处理组小鼠和1只中剂量酪酸梭菌活菌处理组小鼠在实验过程中意外死亡外,其余组小鼠均正常存活至实验结束。(一)小鼠结肠炎症程度评估结果:(1)在疾病活动指数方面,与DSS结肠炎模型组相比,高剂量酪酸梭菌活菌处理组小鼠仅在早期(实验第11天)显著降低了疾病活动指数,而低剂量、中剂量酪酸梭菌活菌在后期(实验第13天)开始显著降低疾病活动指数,P0.05;(2)在结肠大体形态及结肠长度方面,与DSS结肠炎模型组相比,低剂量、中剂量酪酸梭菌活菌可显著减轻结肠黏膜水肿程度及结肠短缩程度,P0.05;(3)在组织学损伤评分方面,与DSS结肠炎模型组相比,低剂量、中剂量酪酸梭菌活菌可显著降低组织学损伤评分,P0.05;(4)在血清炎性因子方面,与DSS结肠炎模型组相比,三个酪酸梭菌活菌处理组均抑制了结肠炎小鼠血清TNF-α表达,但差异无统计学意义,P0.05。(二)小鼠结肠组织上皮-间质转化评估结果:(1)在蛋白水平上,免疫组化显示,三个酪酸梭菌活菌处理组均可上调结肠组织上皮表型E-cadherin的表达,但与DSS结肠炎模型组相比,差异无统计学意义,P0.05;而中剂量、高剂量酪酸梭菌活菌处理组可显著下调间质表型Vimentin表达,P0.05。(2)在mRNA水平,qRT-PCR显示,三个酪酸梭菌活菌处理组均可上调结肠上皮E-cadherin mRNA表达量,但与DSS结肠炎模型组相比,差异无统计学意义,P0.05;而中剂量酪酸梭菌活菌处理组可显著下调结肠间质Vimentin mRNA表达量,P0.05。结论:1、从疾病活动指数、结肠短缩程度、结肠大体观及镜下组织损伤评分、血清TNF-α水平方面,不同剂量酪酸梭菌活菌能够减轻小鼠DSS结肠炎的炎症程度,最佳活菌剂量为108CFU/ml;2、在mRNA和蛋白水平,不同浓度酪酸梭菌活菌能够抑制DSS结肠炎小鼠的结肠组织上皮-间质转化,表现为上调肠上皮表型表达、下调间质表型表达,这种作用以中剂量活菌(108CFU/ml)效果最显著。第二部分酪酸梭菌有效成分对肠上皮细胞间质转化及细胞活性的作用分析目的:探讨两种不同浓度酪酸梭菌上清液和灭活菌对肠上皮细胞发生间质转化的影响及其细胞活性的作用分析。材料与方法:培养IEC-6细胞系作为空白对照组,用10ng/ml人重组TGF-β1刺激IEC-6细胞发生上皮-间质转化,分别用低浓度(106CFU/ml)和高浓度(107CFU/ml)酪酸梭菌上清液及热灭活菌与TGF-β1刺激的IEC-6细胞共培养4天。在实验第2天(Day2)和实验第4天(Day4),从以下两方面评估(1)倒置显微镜观察细胞形态(主要是细胞极性);(2)CCK-8法测定细胞活性。实验结束时,从mRNA水平和蛋白水平上评估菌液上清和灭活菌对上皮-间质转化的影响,即(1)qRT-PCR测定细胞E-cadherin、Vimentin、TGF-β11mRNA表达量;(2)Western blotting法测定细胞E-cadherin、Vimentin蛋白表达量。最后,所有数据采用SPSS20.0进行统计学分析,以P值0.05视为有统计学差异。结果:实验第2天(Day2),CCK-8检测显示,高浓度热灭活酪酸梭菌处理组细胞与其他组细胞相比,细胞活性显著提高(P0.05),其余组之间的细胞活性无统计学差异(P0.05);在实验第4天(Day4),与空白对照组细胞相比,TGF-β1诱导的上皮-间质样变IEC-6细胞活性下降,而高浓度酪酸梭菌上清液和热灭活菌处理后,可提高上皮-间质样变IEC-6的细胞活性,其中,高浓度酪酸梭菌上清液处理组的细胞活性有统计学增高(P0.05)。在肠上皮细胞间质转化方面:(1)倒置显微镜观察,TGF-β1与IEC-6细胞共培养第2天(Day2),细胞极性及紧密连接已受破坏,应用高浓度酪酸梭菌上清液及灭活菌处理后,能够抑制上皮间质转化细胞的极性和紧密连接破坏;实验第4天(Day4),两种浓度的酪酸梭菌上清液及灭活菌均可抑制上皮-间质样变IEC-6细胞间紧密连接及细胞极性的破坏。(2)实验结束提取细胞mRNA,qRT-PCR检测显示,与TGF-β1诱导的上皮间质样变的IEC-6细胞相比,两种浓度的酪酸梭菌上清液及热灭活菌均能显著下调细胞Vimentin mRNA表达量(P0.05);高浓度酪酸梭菌上清液上调细胞E-cadherin mRNA表达最明显,但无统计学差异(P0.05);菌液上清和灭活菌也均可下调细胞TGF-β1 mRNA表达量(P0.05)。(3)实验结束提取细胞蛋白,Western blotting法测定,与间质样变的IEC-6细胞相比,高浓度酪酸梭菌上清液可上调细胞E-cadherin蛋白表达及显著下调细胞Vimentin蛋白表达。结论:酪酸梭菌上清液及灭活菌可抑制IEC-6发生TGF-β1诱导的上皮-间质转化并提高间质转化细胞的细胞活性,以107CFU/ml酪酸梭菌上清液效果最佳。这可能与菌液上清中富含的大量短链脂肪酸有关。
【图文】：
图２各组小鼠不同时间段ＤＡＩ评分图。Ａ图，Ｄａｙｌｌ各组小鼠ＤＡＩ评分；Ｂ图，Ｄａｙｌ２逡逑各组小鼠ＤＡＩ评分；Ｃ图，Ｄａｙｌ３各组小鼠ＤＡＩ评分；Ｄ图，Ｄａｙｌ４各组小鼠ＤＡＩ评分。逡逑＊代表正常组与ＤＳＳ结肠炎模型组间比较，＃代表ＤＳＳ结肠炎模型组与酪酸梭菌活逡逑菌处理组间比较，尸＜０．０５逡逑３０逡逑
图３各组小鼠结肠组织大体观及结肠长度测量。Ａ图，正常对照组；Ｂ图，ＤＳＳ结肠炎模逡逑型组；Ｃ图，低剂量酪酸梭菌活菌处理组；Ｄ阉，中剂量酪酸梭菌活菌处理组；Ｅ图，，尚剂逡逑丨ｆｔ酩酸梭菌活Ｍ处理组逡逑森逦．．邋．邋．＊逦＼邋＾逦＇逦，邋％．－邋－邋＇逡逑Ａ邋、逦－逦＾逦－Ｃ．逦．逡逑ｊｍ邋ｓ：－．，：；；？■－逦．逡逑ｘ邋＾邋－／Ｖ，ｒ．＾：－＇．逡逑卜．s{逦ｖｊ逡逑．务、’？？．’？逦一邋－邋Ｅ邋＊？邋３逦＇逦——逡逑Ｖ邋．ｉ．．：：丨邋Ｔ邋．ｉ邋毛逡逑？■逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R574.62
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本文编号：2629645
