肝细胞核因子4α治疗大鼠实验性肝硬化

发布时间：2020-04-17 01:29

【摘要】：【研究背景及目的】肝硬化(liver cirrhosis)是肝纤维化发展的晚期阶段。在其形成过程中,纤维化程度逐渐加深,在肝组织中形成以纤维包绕的异常肝细胞结节(假小叶)。目前研究已充分表明,肝纤维化是一个动态的可逆的过程,也有研究认为在人类和动物模型中肝硬化可发生逆转,但其能否出现完全逆转仍有较大争议。肝细胞核因子4(hepatocyte nuclear factor, HNF4)是一种属于细胞核激素受体家族的转录因子,在分化成熟的肝细胞中高表达。其中HNF4α是HNF4重要亚型。HNF4α参与维护肝细胞白蛋白合成、药物解毒、能量代谢、胆汁酸合成和脂肪代谢等重要功能,也是调控上皮细胞表型(如紧密连接、粘附连接、缝隙连接、桥粒以及细胞与细胞基质间粘附分子、上皮细胞极性和细胞骨架蛋白等)表达的重要基因。本研究旨在探讨HNF4α对大鼠肝硬化的治疗效果及其机制。【实验方法】一、重组复制缺陷型腺病毒AdHNF4α扩增利用本实验室已构建的表达HNF4α的重组腺病毒载体AdHNF4α,293细胞反复感染,扩增高效表达HNF4α的AdHNF4α和空白对照病毒AdGFP,浓缩纯化、测定滴度后保存。二、AdHNF4α治疗实验性肝硬化将雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为4组,每组8只。第1组为正常对照组;第2~4组予硫代乙酰胺(thioacetamide, TAA)溶液按0.2 g/kg体重腹腔注射。每周注射3次,隔天1次,连续注射15w,制备TAA诱导的大鼠早期肝硬化模型。以同样方式连续注射18周,制备TAA诱导的大鼠晚期肝硬化模型。模型制备完成后,第2组设为模型对照组,第3组设为病毒对照组,第4组设为AdHNF4α导入组。于TAA注射完毕后的三周内分别经尾静脉注入5×10~9 pfu/只AdGFP或5×10~9 pfu/只AdHNF4α,每周2次,共注射6次。末次注射病毒后2周处死所有大鼠,分别观察各组大鼠肝脏大体变化;HE、Masson’s trichrome和Sirius Red染色观察病理变化,检测ECM含量;碱水解法检测各组肝组织羟脯氨酸含量;Real time PCR检测肝脏Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达;Real time PCR检测白蛋白(albumin,ALB)、谷胺酰氨合成酶(glutamine synthetase,GS)、细胞色素P450家族1A2(cytochrome P450 1A2,CYP1A2)肝细胞功能基因的表达;免疫组织化学方法分别检测HNF4α、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、成纤维细胞特异性蛋白-1(Fibroblast specific Protein-1,FSP1)等肝纤维化相关基因的表达。三、AdHNF4α对肝细胞BRL-3A和HSC-T6生物学特性的影响分别用AdGFP或AdHNF4α感染大鼠肝细胞株BRL-3A(MOI=100)和大鼠肝活化星状细胞株HSC-T6(MOI=1200),收集感染后72 h细胞,抽提总RNA及蛋白。Real time PCR和Western blot法检测HNF4α表达,同时测定Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原等肝纤维化相关基因的mRNA量。四、探讨HNF4α治疗实验性肝硬化机制 (一)将病毒感染BRL-3A和HSC-T6,Real time PCR和Western blot法检测细胞HNF4α、肝纤维化相关基因、ERK通路相关基因、组织金属蛋白酶抑制-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1 )及基质金属蛋白酶类( matrix metalloproteinases , MMPs)表达变化。 (二)Real time PCR检测大鼠肝组织标本中ERK通路相关基因MEK1、ERK1、ELK1和纤维溶解系统基因TIMP-1、MMPs表达。免疫组织化学方法检测大鼠肝组织标本中HNF4α、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JunD、JunD、TIMP-1、MMP9、MMP13等蛋白的表达。五、统计学处理数据采用SPSS 11.0统计软件包进行分析,结果以(X|—)±S表示。多组间采用One-Way ANOVA分析,方差齐性则采用非参数检验;P 0.05为具有统计学差异。【实验结果】一、HNF4α治疗实验性大鼠肝硬化 (一)成功建立TAA诱导实验性大鼠肝硬化模型 TAA注射15周后,大鼠肝脏硬度增加,表面呈颗粒状或结节状。病理检查显示,肝细胞变性、坏死,以小叶周边更为显著,汇管区炎症细胞浸润及纤维组织增生,肝内广泛假小叶形成,假小叶内可见纤维再分隔现象,并伴有明显的肝细胞再生结节,表明成功制备实验性早期肝硬化模型。TAA注射18周后,大鼠肝脏硬度增加,表面呈颗粒状或结节状,并且有大量腹水形成,病理检查显示肝硬化程度加深,表明大鼠已进入晚期肝硬化。 (二)肝硬化形成过程中HNF4α表达逐渐下降 Real time PCR和免疫组织化学检测显示,伴随着肝硬化的发展,HNF4α的表达明显下调;AdHNF4α导入后大鼠肝组织大量表达HNF4α(P0.05)。 (三)HNF4α逆转大鼠早期肝硬化大鼠肝硬化形成早期(15周),通过尾静脉注射AdHNF4α或AdGFP。AdHNF4α治疗组大鼠肝脏质地柔软,表面较光滑。HE、Masson和Sirius Red染色显示HNF4α治疗组大鼠肝脏硬化程度明显减轻,假小叶结构消失,提示HNF4α可逆转早期肝硬化。模型对照组和AdGFP组羟脯氨酸含量分别为327.37±27.43μg/g和338.1±39.57μg/g,相比无统计学差异(P0.05);AdHNF4α治疗组羟脯氨酸含量为252.65±19.93μg/g,较上述两个对照组明显减少,差异具有统计学意义(P0.05)。分析软件结果显示,AdHNF4α组胶原染色面积约为AdGFP组的32%(P0.05)。Real time PCR检测提示AdHNF4α治疗组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原较AdGFP组表达降低(P0.05)。 (四)HNF4α保护大鼠肝功能血清生化检测显示,AdHNF4α治疗后ALT、AST分别为59.3±2.52U/L、142±7 U/L,与AdGFP组(71±4.58 U/L、176.3±7.5U/L)比较明显降低,差异具有统计学意义(P0.05);Real time PCR结果显示,AdHNF4α治疗后肝组织肝功能相关基因ALB、GS和CYP1A2表达较AdGFP对照组升高(P0.05)。 (五)HNF4α抑制大鼠肝纤维化相关基因表达免疫组织化学检测提示,AdHNF4α治疗组肝纤维化相关基因:α-SMA、FSP1和TGF-?1表达较AdGFP对照组明显降低(P0.05)。 (六)HNF4α减轻晚期肝硬化大鼠肝纤维化大鼠肝硬化形成晚期(18周),通过尾静脉注射AdHNF4α或AdGFP。AdHNF4α治疗组大鼠肝脏表面仍然呈颗粒状或结节状。HE、Masson和Sirius Red染色显示HNF4α治疗组大鼠肝脏纤维化程度较AdGFP对照组减轻(P0.05)。但病理检查显示,肝内仍存在假小叶。提示HNF4α仅可减轻晚期肝硬化纤维化程度,而不能逆转其肝硬化。二、HNF4α抑制ERK通路的活性 (一)HNF4α抑制大鼠肝细胞和肝星状细胞株ERK通路活性 AdHNF4α感染肝细胞株BRL-3A和HSC-T6细胞72 h后,Real time PCR检测显示,AdHNF4α治疗组ERK1以及其下游基因ELK1表达较AdGFP对照组明显降低(P0.05),而ERK1上游基因MER1表达呈负反馈性上调(P0.05)。Western blot法发现,AdHNF4α治疗组HSC-T6细胞p-ERK、p-JunD表达较AdGFP对照组明显降低,而ERK1/2、JunD的表达较对照组未见明显差异。 (二)HNF4α抑制实验性肝硬化大鼠肝脏ERK通路活性 Real time PCR检测显示,AdHNF4α组肝组织ERK1及其下游基因ELK1表达较对照组明显降低(P0.05),ERK1上游基因MER1表达略增加(P0.05)。免疫组织化学检测提示AdHNF4α治疗组肝脏p-ERK、ERK1/2及其调控的p-JunD、JunD表达较AdGFP对照组明显减少。三、HNF4α调节纤维溶解系统的平衡 (一)HNF4α调节大鼠肝细胞和肝星状细胞株TIMP-1、MMPs的表达 AdHNF4α感染BRL-3A、HSC-T6细胞72 h后,Real time PCR检测显示TIMP-1表达较AdGFP对照组明显降低(P0.05),MMP2、MMP9和MMP13的表达上调(P0.05)。Western blot法结果显示AdHNF4α治疗组HSC-T6细胞TIMP-1表达较AdGFP对照组明显降低。AdHNF4α作用停止后,HSC-T6的TIMP-1表达随之升高。 (二)HNF4α调节实验性肝硬化大鼠肝脏TIMP-1、MMPs表达 Real time PCR检测显示AdHNF4α治疗组TIMP-1表达较AdGFP对照组明显降低(P0.05),MMP2的表达略升高(P0.05),而MMP9、MMP13的表达较对照组无统计学差异。免疫组织化学检测提示,伴随肝硬化逆转,成纤维细胞减少,AdHNF4α治疗组TIMP-1表达较AdGFP对照组降低,MMP2、MMP9和MMP13分泌较AdGFP对照组减少。【结论】一、肝硬化进程中,肝细胞HNF4α表达逐渐降低。二、AdHNF4α体内导入可逆转早期肝硬化,促进肝功能恢复,是治疗实验性肝硬化新的有效方法。但是不能完全逆转晚期肝硬化。三、HNF4α逆转肝硬化机制与下调ERK通路活性和调节TIMP-1/ MMPs平衡有关。
【图文】：

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将 25 μl 病毒与 475 μl TE 液充分混匀，13,000 rpm 离心 5 min，分光 OD260值，病毒滴度 pfu/ml=OD260×1012。三）肝硬化化动物模型制备1．TAA 损伤早期肝硬化模型将雄性 SD 大鼠随机分为 4 组，每组 8 只，第 1 组为正常对照组，2~ 按 0.2 g/kg 剂量腹腔注射。每周注射 3 次，隔天注射，连续注射 15A 诱导的大鼠早期肝硬化模型。其中第 2 组设为 Model 组，第 3 组为组，第 4 组为 AdHNF4α 治疗组。末次 TAA 注射后 1 周，分别经尾109pfu/只 AdGFP 或 5×109pfu/只 AdHNF4α，每周两次，共三周（图 1 w 处死大鼠，取相同部位肝组织中性甲醛固定，制备石蜡切片；其氮冻存。

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肝细胞核因子 4α治疗大鼠实验雄性 SD 大鼠随机分为 4 组，每组 8 只，第 1 组为正常对照组；2 0.2 g/kg 剂量腹腔注射。每周注射 3 次，隔天注射，连续注射 1A 诱导的大鼠肝硬化模型。其中第 2 组设为 Model 组，，第 3 组为，第 4 组为 AdHNF4α 治疗组。末次 TAA 注射后 1 周，分别经尾09pfu/只 AdGFP 或 5×109pfu/只 AdHNF4α，每周两次，共三周（图w 处死大鼠，取相同部位肝组织中性甲醛固定，制备石蜡切片；其冻存。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R575.2

【参考文献】