阻塞性胆汁淤积中miR-200b-3p抑制胆汁酸合成酶及上调转运蛋白OATP3A1的机制研究

发布时间：2020-04-17 01:41

【摘要】：研究背景:胆汁淤积(cholestasis)是一种由于多种原因导致的胆酸、胆红素等排泄物不能从肝脏正常排出,进而导致肝脏胆酸水平升高而引起的一系列病症的消化系统疾病。胆汁淤积早期,肝脏会产生一系列适应性反应,以保护肝脏,主要包括:降低肝内胆汁酸的合成、减少胆汁酸的摄取、促进胆汁酸的外排以及增高肝脏解毒酶的活性等。若病变超出肝脏适应性反应代偿范围,可造成肝损伤、肝纤维化,甚至肝硬化等。胆酸等化合物的转运主要依靠肝细胞膜上的膜转运蛋白,主要包括NTCP(Na~+-taurocholate cotransporting polypeptide)、MRPs(multidrug resistance-associated proteins)以及OATPs(organic-anion-transporting polypeptides)等转运蛋白。目前研究发现人体中存在11种OATPs转运蛋白,其中OATP1A2,OATP1B1,OATP1B3和OATP2B1研究较多。有研究发现,在人胆汁淤积肝脏中,OATP1B1和OATP1B3显著降低,可以显著减少肝细胞对胆汁酸的摄取,减轻胆酸在肝细胞内的聚积,从而保护肝脏。OATP3A1位于肝细胞基底外侧膜,其转运底物主要包括胆汁酸、胆红素等化合物。研究表明,OATP3A1在胆汁淤积中表达升高,具有促进肝内胆汁酸排出和保护肝脏的作用。胆固醇7α-羟化酶(Cholesterol 7 alpha-hydroxylase,CYP7A1)是胆汁酸合成的主要限速酶,可将胆固醇转换为胆汁酸。研究报道,CYP7A1在酒精性肝病和胆汁淤积患者中受到显著抑制,进而降低肝内胆汁酸的合成,从而减少胆酸对肝细胞的损伤。肝受体同源物-1(liver receptor homolog-1,LRH-1)是一种核受体,由NR5A2基因编码,主要在肝脏,肠道和胰腺中表达。LRH-1可促进CYP7A1和CYP8B1转录,并参与胆汁酸稳态和胆固醇转运。微小RNA(microRNA,miRNA)是一种短链非编码RNA,可通过与下游靶基因3’UTR区域结合从而降解靶基因,调节靶基因的表达。miR-200家族广泛存在于人体的各个组织中,研究较为广泛,参与多种生物学活动的过程,主要包括miR-200a,miR-200b,miR-200c,miR-141以及miR-429等,miR-200b在细胞中分解为miR-200b-3p和miR-200b-5p,进而调节靶基因的表达。以往对miR-200b-3p的研究较少,前期我们通过胆汁淤积人肝组织miRNA基因芯片筛查,发现miR-200b-3p表达显著升高,在人肝组织中尚未得到验证,同时miR-200b-3p与OATPs和胆汁酸合成酶之间是否存在相关关系,目前尚不清楚,本研究通过收集35例人体组织标本,对患者miR-200b-3p的表达及其与OATPs和胆汁酸合成酶之间的关系进行探讨。研究方法:1.收集35例在我院肝胆外科行肝脏手术的患者肝组织样品,其中阻塞性胆汁淤积患者24例,正常对照组患者11例,所有手术取到的肝脏样品立即切成约30mg的小块,装在冻存管内,放入液氮罐内保存,用时取出适量肝组织。2.通过酶标法检测所有入组患者的肝功能,主要观察包括:AST,ALT,ALP,GGT,TBIL,DBIL,IBIL以及TBA等指标。3.通过胆汁淤积患者与正常对照患者组织进行3x3的miRNA芯片检测,发现差异较为显著的相关miRNAs,并采用实时定量PCR检测阻塞性胆汁淤积和正常对照组的miR-200b-3p、miR-4665-5P、miR-363-5p及miR-3609等基因的mRNA表达水平。4.MiR-200b-3p与肝功能指标进行相关性分析。5.检测人肝组织中胆汁酸代谢相关基因LRH-1,CYP7A1及CYP8B1等表达。6.采用50ng/mL的FGF19,TNF-α,IL-1β,IL-8,IP-10,HGF及TWEAK等因子处理HepG2细胞12h,采用0、5、25、50 ng/mL的FGF19处理HepG2细胞12h,采用50ng/mL FGF19分别处理0、1、3、6、12和24h。提取细胞总RNA,检测miR-200b-3p表达。探讨诱导调控miR-200b-3p表达的因子。7.采用miR-200b-3p mimics转染HepG2细胞24h后,分别提取细胞总RNA和总蛋白,采用RT-PCR检测miR-200b-3p表达,确认其转染至细胞。采用RT-PCR检测胆汁酸合成相关酶(CYP7A1,CYP7B1,CYP8B1,CYP27A1)、核受体(LRH-1,FXR,HNF4α,HNF1α,SHP)、肝脏解毒酶(GSTM1-4,GSTA1-4,CYP3A4,UGT2B4,UGT2B7,SULT2A1)、膜转运蛋白(MRP2,MRP3,OSTα,OSTβ,OATP3A1)等基因的mRNA表达水平。通过Western Blot检测LRH-1,CYP7A1,CYP8B1,MRP3以及OATP3A1等基因的蛋白表达水平。8.采用miR-200b-3p mimics转染PLC5细胞24h后,分别提取细胞总RNA和总蛋白,采用RT-PCR检测miR-200b-3p和OATP3A1的mRNA表达水平,通过Western Blot检测OATP3A1的蛋白表达水平。9.采用miR-200b-3p inhibitor转染HepG2和PLC5细胞24h后,分别提取细胞总RNA和总蛋白,采用RT-PCR检测miR-200b-3p和OATP3A1的mRNA表达水平,通过Western Blot检测OATP3A1的蛋白表达水平。10.预测、设计并合成miR-200b-3p与LRH-1结合的野生序列(LRH-1-wt)和突变序列(LRH-1-mut)到pmirGLO质粒中,同采用双荧光素酶报告基因实验(luciferase reporter gene assay)检测两种荧光素酶活性。实验结果:1.阻塞性胆汁淤积患者的AST、ALT、ALP、GGT、TBIL、DBIL、IBIL及TBA等血液肝功能指标均明显高于正常对照组患者(P0.05)。2.实时定量PCR证实:在阻塞性胆汁淤积组患者肝脏中miRNA-200b-3p表达量是正常对照组患者肝组织样品的1.8倍(P0.05)。3.在miRNA-200b-3p表达高组中,患者TBA降低,且两者呈负相关关系(P0.05),与其他肝功能指标无明显相关性(P0.05)。4.胆汁淤积性肝组织中,LRH-1和CYP8B1显著上调,而CYP7A1显著下调。在miR-200b-3p高表达组中,LRH-1和CYP8B1显着低于miR-200b-3p低表达组(P0.05);CYP7A1显著低于对照组(P0.05);且miR-200b-3p与LRH-1和CYP8B1呈负相关关系。5.FGF19可诱导miR-200b-3p升高2.6倍(P0.01),且呈显著的时间和量效依赖关系(P0.01),其他IL-1β、IL-8、IP-10、TNF-α、HGF、TWEAK等因子对miR-200b-3p影响无明显差异(P0.05)。6.miR-200b-3p mimics转染到HepG2细胞,24h后提取总RNA和总蛋白,miR-200b-3p表达量显著升高(P0.01),LRH-1、CYP7A1及CYP8B1的表达显著降低(P0.05),OATP3A1表达显著升高(P0.05)。7.miR-200b-3p mimics转染到PLC5细胞,24h后提取总RNA和总蛋白,miR-200b-3p表达量显著升高(P0.01),OATP3A1表达显著升高(P0.05)。8.miR-200b-3p inhibitor转染到HepG2和PLC5细胞,24h后提取总RNA和总蛋白,miR-200b-3p表达显著降低(P0.05),OATP3A1表达显著降低(P0.05)。9.荧光素酶报告基因实验显示:pmirGLO-LRH-1 wt和miR-200b-3p mimics共同转染组的荧光素酶的相对活性显著下降(P0.05),此外,在pmirGLO-LRH-1 mut组中,荧光素酶的相对活性显著上升至正常(P0.05),提示miR-200b-3p可与LRH-1相结合。实验结论:1.在阻塞性胆汁淤积人肝组织中,miR-200b-3p表达显著升高,通过相关性分析发现miR-200b-3p与TBA呈负相关关系,提示其可能参与胆汁酸的代谢及转运;2.细胞因子FGF19可诱导miR-200b-3p表达升高,且具有时间和量效依赖关系;3.miR-200b-3p可能是通过抑制核受体LRH-1的表达,进而下调胆汁酸合成酶CYP7A1和CYP8B1的表达,从而减少肝内胆汁酸合成;同时,miR-200b-3p可间接上调OATP3A1的表达,增加胆汁酸外排,从而在一定程度上减轻肝细胞内胆汁酸的蓄积,起到保护肝细胞的作用。
【图文】：

表达水平,患者,胆汁淤积,阻塞性

陆军军医大学硕士学位论文NAs 的相对表达水平。实验结果表明，阻塞性胆汁淤积组患者b-3p 是正常对照组的 1.8 倍（图 1，P＜0.05），然而，两组患5-5p、miRNA-363-5p 以及 miRNA-3609 差异无明显统计学意研究探讨 miRNA-200b-3p 在阻塞性胆汁淤积患者中的作用，b-3p 与肝功能指标进行相关性分析。

肝功能,胆汁淤积,胆汁酸,阻塞性

图 2. miRNA-200b-3p 高表达组和低表达组的肝功能比较.4 在 miRNA-200b-3p 高表达组中，miRNA-200b-3p 与 TBA 呈负相关关系探讨 miRNA-200b-3p 在阻塞性胆汁淤积患者中的作用，将其相对表达量与指标进行 Pearson 相关性分析。结果表明，，在 miRNA-200b-3p 高表达组0b-3p 与 TBA 呈显著的负相关关系(图 2，P＜0.05)，与其他肝功能指标无(图 2，P＞0.05)。上述结果提示 miR-200b-3p 可能参与了胆汁酸的代谢过制和降低胆汁酸水平的作用，其具体机制目前尚不清楚。此外，miR-200性胆汁淤积患者中受到何种因子的调控和影响，目前均尚不清楚。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575

【相似文献】