HO-1修饰的骨髓间充质干细胞对受损肠道保护作用及其机制的研究

发布时间：2020-04-17 05:03

【摘要】：目的：1.探讨骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BM MSCs)对体内外活化T细胞的免疫调节作用。2,探讨血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)修饰的BM MSCs (HO-1/MSCs)及BM MSCs在单层肠上皮细胞环境中产生的免疫调节及其机制。3.初步探讨HO-1/MSCs及BM MSCs在肠缺血再灌注损伤中的保护作用及其机制。 方法：1.取4-5周龄健康、雄性Wistar大鼠,采用密度梯度离心联合贴壁筛选法分离培养BM MSCs,流式细胞术鉴定第3代细胞的表型。2.建立体外共培养模型：采用混合淋巴细胞共培养,在6孔板加入CaCo-2细胞建立单层肠上皮环境模型,将BM MSCs及HO-1/MSCs消化计数,每孔加入2×105个/mL,大鼠新鲜悬浮脾淋巴细胞计数每孔加入1×106个/mL,在除外空白组的各组加入10μg/mL的刀豆蛋白A(ConA)以刺激T淋巴细胞增殖。实验分3个时间点：分别为0、24、48h,每个时间点7组,实验组(脾淋巴细胞、HO-1/MSCs、CaCo-2、ConA)、对照组A(脾淋巴细胞、BM MSCs、CaCo-2、ConA),对照组B(脾淋巴细胞、CaCo-2、ConA),对照组C(脾淋巴细胞、HO-1、MSCs、ConA),对照组D(脾淋巴细胞、BM MSCs、 ConA),增殖组(脾淋巴细胞、ConA),空白组(脾淋巴细胞)。MTT检测T淋巴细胞活性,ELISA检测细胞因子TNF-α、IL-10及TGF-1β水平,流式检测Foxp3+调节性T细胞表达率。3.模拟小肠移植肠缺血时间建立大鼠体内肠道缺血再灌注损伤环境模型：取6-8周龄健康、雄性Wistar大鼠,术前均禁食12h,于无菌环境下分离大鼠的肠系膜上动脉,夹闭40min后松开血管夹,注射单细胞悬液或者相同剂量的生理盐水,关腹,建立肠缺血再灌注损伤模型。4.将模型组分4组：实验组(lml HO-1/MSCs细胞经肠黏膜下植入)和BM MSCs对照组(lml BM MSCs细胞经肠黏膜下植入),生理盐水对照组(1ml生理盐水经肠黏膜下植入),假处理组(开腹后不做任何处理,40min后关腹),各组分别于术后24h处死大鼠,留取动物血清和小肠组织标本备用；5.采用酶联免疫法检测TNF-α的水平及免疫调节因子IL-10及TGF-1β水平；光镜下观察小肠组织的病理变化。 结果：1.体外成功分离培养出BM MSCs,经流式鉴定第3代贴壁细胞阳性表达CD29、CD90及RT1A均达90%以上,载有HO-1的腺病毒转染第3代BM MSCs成功率达80%以上。2.成功建立大鼠体外肠道环境共培养模型：①MTT检测脾脏T淋巴细胞0h、24h、48h活性,经LOG10转换后,实验组24h、48h分别为-0.447±0.067、-0.455±0.027, BM MSCs对照组为-0.321±0.028、-0.323±0.026,两组比较差异有统计学意义(P0.05)。②ELISA检测TNF-α、IL-10, TGF-1β水平,TNF-α、IL-10、 TGF-1β水平Oh实验组与对照组无差别,分别为69.865±18.953、275.92±9.714、275.92±9.714, BM MSCs对照组24h、48hTNF-α水平为95.737±5.981、96.471±7.863,实验组为57.444±18.41、63±8.718；BM MSCs对照组IL-10水平24h、48h为404.949±10.181、366.016±5.18,实验组为586.154±15.783、638.718±41.154；BM MSCs对照组TGF-1β水平24h、48h为441.27±12.716、433.231±29.224,实验组为522.285±25.686、501.123±11.609；差异均有统计学意义(P0.05)。③流式细胞仪检测T调节细胞表达率,其中24h、48h实验组FoxP3+T调节细胞表达率均高于对照组,分别为实验组8.1%、8.6%,BM MSCs对照组0.2%、0.1%。3.模拟小肠移植肠缺血时间点,成功建立大鼠体内肠缺血再灌注损伤模型,①ELISA检测TNF-α、IL-10, TGF-1β水平,其中BM MSCs对照组、实验组TNF-α水平24h分别为51.877±2.2、31.827±4.681,TGF-1β水平24h分别为748.79±87.943、1097.566±198.582,IL-10水平24h分别为995.956±57.057、1357.963±115.003。差异均有统计学意义(P0.05)。②形态学方面：BM MSCs对照组24h小肠组织HE染色显示：小肠绒毛水肿、肠上皮细胞坏死、肠道间质充血及炎症细胞浸润程度与同时间点实验组相比明显较重。 结论：1.密度梯度离心联合贴壁法方法简单、可以大量体外扩增BM MSCs,纯度较高。2.在体外共培养肠上皮环境下,BM MSCs可以通过抑制炎性因子TNF-α的表达及促进免疫调节因子TGF-1β IL-10及T调节细胞的表达发挥免疫调节作用,这一免疫调节作用的发挥可以被成功载入的HO-1所放大。3.在肠缺血再灌注损伤模型中,BM MSCs可以明显修复小肠黏膜上皮结构、减轻小肠通透性,因此BM MSCs对大鼠肠缺血-再灌注损伤具有保护作用,HO-1/MSCs中载入的HO-1可放大这一保护作用。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R574.5

【参考文献】

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本文编号：2630483