TLR3在人类胎盘HBV感染中作用的研究

发布时间：2020-04-17 09:21

【摘要】： 目的为了研究TLR3在人类胎盘HBV感染中的作用,本课题采用人群研究和体外实验相结合的方法,从基因和蛋白水平初步了解正常孕妇人群与HBsAg阳性孕妇人群胎盘组织TLR3的表达和分布情况以及与HBV宫内感染的关系,根据人群研究提供的线索进一步进行体外实验,探索TLR3在胎盘细胞抵御HBV感染中的作用。 ①了解TLR3受体在正常孕妇和HBsAg阳性孕妇胎盘组织的基因表达及蛋白分布情况; ②了解胎盘组织TLR3 mRNA表达与孕妇HBV感染的关系;从基因水平了解胎盘组织TLR3 mRNA与孕妇外周血HBV DNA含量的关系以及与新生儿HBV宫内感染的关系;从蛋白水平了解TLR3与胎盘HBV感染的关系及与新生儿HBV宫内感染的关系; ③研究HBV感染对人胎盘滋养层细胞系Bewo中TLR3 mRNA表达的影响,观察人胎盘滋养层细胞系Bewo中TLR3抗HBV感染的生物学作用。 方法①普通半定量RT-PCR和Real time RT-PCR检测正常孕妇和HBsAg阳性孕妇胎盘组织TLR3 mRNA的表达情况,免疫组织化学ABC法检测正常孕妇和HBsAg阳性孕妇胎盘组织TLR3分布情况: ②荧光定量PCR检测HBsAg阳性孕妇及其新生儿HBV DNA含量: ③建立HBV体外感染人胎盘滋养层细胞模型;高浓度HBV DNA阳性血清与Bewo细胞共培养,荧光定量PCR法检测培养上清中HBV DNA含量:免疫组织化学ABC法检测细胞爬片Bewo细胞中HBsAg: ④普通半定量RT-PCR和Real time RT-PCR检测人胎盘滋养层细胞系Bewo中TLR3mRNA的表达;HBV感染前后人胎盘滋养层细胞系Bewo中TLR3 mRNA表达的变化;利用PolyI:C刺激Bewo细胞TLR3 mRNA的表达,设计合成特异的siRNA阻抑Bewo细胞TLR3 mRNA的表达,同时设对照组,Real time RT-PCR检测三组细胞经不同措施干预后TLR3 mRNA的表达变化,同时检测用10~8copies/ml浓度的HBV DNA阳性血清与上述三组细胞共同培养后上清液中HBV DNA含量的变化。 结果①半定量RT-PCR和Real time RT-PCR结果均显示nBsAg阳性孕妇胎盘组织TLR3mRNA含量低于正常孕妇胎盘组织(t=3.003,P＜0.05;t=4.698,P＜0.05);免疫组化检测41例正常孕妇胎盘TLR3全部阳性,且各层细胞均显示很强的免疫印迹,呈片状分布;所检116例外周血HBsAg阳性孕妇胎盘组织中73.0%TLR3受体阳性,棕黄色信号局灶性分布于被检胎盘的各型细胞中;TLR3在两组的胎盘分布经统计学检验差异有显著性(Fisher's确切概率P＜0.01); ②胎盘组织TLR3 mRNA水平与孕妇外周血HBV DNA含量无关(F=0.147,P＞0.05);胎盘组织TLR3 mRNA水平与新生儿宫内感染无关(t=0.888,P＞0.05); ③从蛋白水平研究TLR3与胎盘HBV感染及与新生儿HBV宫内感染的关系,结果显示TLR3阳性不仅是胎盘HBV感染的保护因素(OR=0.259,0.189～0.354),同时也是新生儿HBV宫内感染的保护因素(OR=0.438,0.204～0.942)之一。 ④HBV DNA阳性血清与Bewo细胞共培养24小时组、48小时组,在细胞感染后不同时段(24小时、48小时、72小时)的培养上清中均可检出HBV DNA;免疫组织化学ABC法检测细胞爬片Bewo细胞内HBsAg的表达,阳性物质呈细小棕黄色颗粒,多数呈胞浆均质型,少数呈胞浆不均质型,少数细胞核内亦可见阳性表达。光镜下HBsng阳性细胞未见形态学上的明显变化。 ⑤经普通半定量RT-PCR和Real time RT-PCR检测证实人胎盘滋养层细胞系Bewo中TLR3 mRNA的表达呈阳性;HBV感染Bewo细胞后TLR3 mRNA表达高于对照组(t=4.479,P＜0.05);PolyI:C刺激Bewo细胞后TLR3 mRNA的表达水平高于siRNA组和对照组(H=13.087,P＜0.05;H=13.100,P＜0.017),siRNA组和对照组细胞TLR3 mRNA含量无差别(H=3.287,P＞0.05);用10~8copies/ml浓度的HBV DNA阳性血清与上述三组细胞共同培养后,三组均可检出HBV DNA,PolyI:C组上清中HBV DNA含量低于siRNA组和对照组,差异有统计学意义(F=8.531,P＜0.05);siRNA组和对照组差异无统计学意义(LSD检验P＞0.05)。 结论①胎盘组织TLR3表达情况与孕妇乙型肝炎病毒感染有关,TLR3高表达是孕妇乙型肝炎病毒感染的保护因素; ②蛋白水平的检测结果显示,HBsAg阳性孕妇胎盘组织TLR3阳性率低于正常孕妇胎盘组织,TLR3是孕妇胎盘HBV感染的保护因素,同时也是HBV宫内感染的保护因素; ③乙型肝炎病毒可在体外成功感染人胎盘滋养层细胞系Bewo;体外培养的人胎盘滋养层细胞系Bewo可稳定表达TLR3,也可被乙型肝炎病毒直接感染,故此模型可作为研究HBV胎盘感染机制的良好工具: ④Bewo细胞受HBV感染后TLR3 mRNA表达上调;PolyI:C刺激可使Bewo细胞TLR3 mRNA表达上调,抗乙型肝炎病毒能力增强。 ⑤研究结果表明HBV感染与人体初始免疫有关,TLR3在胎盘细胞抵御HBV感染中发挥重要生物学作用,TLR3为胎盘HBV感染及新生几HBV宫内感染的保护因素,人群研究和体外实验结果基本一致,该研究结果将为乙肝防治和HBV宫内感染的预防及治疗提供新思路。
【图文】：

.3.2半定量盯一pcR技术检测胎盘组织 TLR3mRNA的表达情况用半定量逆转录聚合酶链反应(Rl’ -pCR)技术检测HBsAg阳性孕妇和正常孕妇胎盘组织 TLR3n1RNA的表达情况，结果见表1一3和图1一1。HBsAg阳性孕妇组TLR3吸光度比值(TLR3/p一aetin)均数为0.4175士0.2216，，正常孕妇组为0.6387士0.2053，两组资料符合正态性和方差齐性。 TLR3n1RNA在HBsAg阳性孕妇组的表达低于正常孕妇组(t=3.003，p (0.05)。表1一3半定量RT-PCR技术检测胎盘组织 TLR3mRNA的表达分组例数吸光度t匕值TLR3/p一aetinHBsAg阳性孕妇组正常孕妇组1422 0.4175士0.2216 0.6387士0.2053拼 3.003，尸=0005图1一 1:TLR3RT一pCR产物1.7%琼脂糖凝胶电泳图 M:PCRMarker:日一 aetin，从上至下依次为:600bp、SOObp、400bp、300bp、ZOObp、10Obp(285bp)2:TLR3(477bD)

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【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R512.62;R714.2

【参考文献】

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本文编号：2630707