肝细胞来源的miR-194激活PMVEC促进血管生成在肝肺综合征中的作用及机制

发布时间：2020-04-17 11:00

【摘要】：研究背景和目的:肝肺综合征(hepatopulmonary syndrome,HPS)是在慢性肝病和/或门脉高压的基础上出现肺内微血管异常扩张(intrapulmonary micro-vessel dilation,IPVD)、气体交换障碍、动脉血氧合作用异常而导致的一种严重肺部并发症。其发生明显增加了肝病患者围术期死亡率,也是引起术后移植肝无功能及肺部感染的主要原因,已经引起了国内外肝病学和危重病学专家的极大关注。研究报道肝移植术后普通肝硬化患者存活时间中位数为87个月,5年生存率为63%,而肝肺综合征患者仅24个月,5年生存率仅23%。中国是肝病大国,肝肺综合征的发生会显著增加患者、医院和社会的医疗负担。血管新生是一个由众多细胞和信号通路参与的过程,在癌症、类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病的发生发展中起重要作用。新生血管与一般血管相似,其作用是通过血液将氧气与养分输送到细胞,但是,除外某些特定的生理情况,如怀孕、创口修复等,当出现过度的、病理性血管新生时,往往引发疾病。既往文献报道和我们前期研究中发现HPS重症化更为重要的病理特征是肺部病理性微血管新生的形成,亟待针对其机制进行深入研究。此外,新近研究发现外泌体广泛参与多种疾病的病理生理过程,并发挥了重要的作用。但外泌体在肝肺综合征发生和发展中的作用,目前尚不清楚。因此,本文以CBDL大鼠结扎诱导的大鼠肝肺综合征模型为研究对象,研究外周血液中外泌体在肝肺综合征病理性血管新生过程中的作用及具体分子机制,研究结果对深入理解肝肺综合征的发生机制具有重要意义,为HPS的治疗提供理论依据。此外,群体细胞迁移在血管生成过程中有重要作用。为了更好的理解细胞群体迁移的调控机制,我们决定选择果蝇卵室发育过程中发生群体细胞迁移的边界细胞团作为研究对象,开展相关研究,以期发现其中的一些共性,更好的阐明肝肺综合征血管新生过程的具体机制。研究方法:1.构建HPS大鼠模型,提取并鉴定血清外泌体,观察PMVECs对其的吸收情况构建运用胆总管结扎术(CBDL)诱导的HPS大鼠模型,5周后进行血气、肝功、血流动力学测定以及肝肺组织病理切片分析,取假手术组和HPS组大鼠外周动脉血血清运用差速离心法提取外泌体,运用Western blot、TEM和NTA法鉴定外泌体,再用BCA测定外泌体浓度变化。最后,运用PKH67标记外泌体,与PMVECs共培养,观察对外泌体的吸收情况。2.观察血清外泌体对PMVECs增殖、迁移及成管的影响将血清外泌体与PMVECs共培养,通过流式细胞术分析细胞周期及增殖情况;运用Transwell小室实验和划痕试验观察PMVECs的迁移情况;采用Matrial胶体外管腔形成法观察成管能力的变化。3.利用miRNA生物芯片筛查外泌体miRNA差异表达谱,并进行qRT-PCR验证对大鼠外周血血清外泌体进行miRNA生物芯片筛查,得到差异表达的miRNA,运用qRT-PCR进行验证。4.观察miR-194对PMVECs增殖、迁移及成管的影响将miR-194激动剂和抑制剂转染PMVECs,通过流式细胞术分析细胞周期及增殖情况;运用Transwell小室实验和划痕试验观察PMVECs的迁移情况;采用Matrial胶体外管腔形成法观察成管能力的变化。5.生物信息学分析并验证潜在的miR-194靶基因运用Targetscan数据库预测miR-194的靶基因,运用Amigo数据库搜集负调控血管生成的基因,取两组数据的交集,得到miR-194潜在的调控血管生成的靶基因,运用双荧光素酶检测系统进行验证。6.分析HPS时血清中增加的外泌体的分泌细胞对可能导致血清外泌体和外泌体内miR-194增加的细胞进行筛查,并模拟体内条件运用胆汁酸刺激筛查出的细胞,观察其分泌外泌体和miR-194的变化7.在体和离体水平验证肝细胞内P53通路介导的外泌体分泌在HPS血管生成中作用运用P53抑制剂pifithrin-μ、P53 RNAi探讨P53对胆汁酸处理后肝细胞中TASP6表达、培养基里外泌体浓度以及外泌体miR-194含量的影响。CBDL模型大鼠静脉注射pifithrin-μ、GW4869或anta-miR-194,观察其对肺血管生成及存活率的影响。进一步分析了HPS患者和大鼠血清胞外泌体miR-194水平和P(A-a)O_2的相关性。8.在果蝇卵室内利用活体成像和光遗传学技术,观察Myo-II流动在群体细胞迁移中的具体作用结果:1.成功构建运用胆总管结扎术(CBDL)诱导的HPS大鼠模型,并从外周血清中提取出外泌体,发现肝肺综合征大鼠血清外泌体浓度存在显著改变,PKH-67标记的血清外泌体可以被PMVECs吸收。2.来源于肝肺综合征大鼠血清的外泌体可以显著促进PMVECs的增殖、迁移及成管效应。3.miRNA生物芯片及qRT-PCR验证结果提示miR-194在肝肺综合征大鼠血清的外泌体内表达显著升高。4.miR-194可以显著促进PMVECs的增殖、迁移及成管效应。5.miR-194发挥的促血管生成效应可能是由其靶基因THBS1,STAT1和LIF介导的。6.胆汁酸刺激下,肝细胞分泌的外泌体和外泌体miR-194增加。7.胆汁酸刺激下,P53核转位增加。pifithrin-μ和P53 RNAi均显著抑制TASP6表达、下调培养基中外泌体浓度和外泌体miR-194水平。在体情况下,CBDL模型大鼠静脉注射pifithrin-μ、GW4869或anta-miR-194治疗后,血清外泌体浓度降低,外泌体源性miR-194水平也降低,肺血管生成减少,存活率提高。8.研究发现群体细胞迁移过程中存在两种不同的Myo-II流,它们与E-钙黏素偶联,控制着边界细胞在护理细胞之间移动时前端突起的生长和后端细胞膜间的分离。前导细胞中Myo-II和E-钙黏素的双向流动与突起的生长和肌动蛋白逆向流动相关,它们反过来控制突起的生长和肌动蛋白的极化。相反,在跟随细胞中,单向脉冲式Myo-II和E-钙黏素流促进了其与护理细胞间的动态分离。结论:1.我们证明了肝肺综合征大鼠血清外泌体miR-194介导肝细胞与PMVEC之间的串话,并有助于PMVEC增殖,迁移和管形形成。外泌体/miR-194轴在肺血管新生中起关键的病理作用。这些发现表明,外泌体可能是肝肺综合征治疗的一个潜在的靶点。2.果蝇卵室边界细胞群体迁移过程中独特的Myo-II流动作为一个关键的生物力学机制,控制多细胞环境里群体细胞迁移过程中前导细胞突起的生长和跟随细胞膜的分离。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575;R563

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