【摘要】：研究背景和目的:酗酒是一项遍及全球的社会问题,在我国尤甚。在中国,由此引发的肝脏疾病的发生率一直居高不下,但迄今仍未摸索出强有效的防治模式和药物。正是基于此种强效防控手段的缺失,在医学迅速发展的当代重症酒精性肝脏疾病(alcoholic liver disease,ALD)依然保持着高致残率及较差的临床结局。不同于病毒性肝炎抗病毒治疗的飞速发展,目前临床上对于重症酒精性肝炎患者有效的治疗措施仍然仅限于糖皮质激素以及肝脏移植。患病率持续走高与防治方式停滞不前的现实落差导致对研发新药的需求愈加迫切。近年来,肝脏固有免疫系统逐步成为拓展ALD治疗思路的新方向。随着各器官固有免疫网络的逐步成形,人们对其功能的认知已经提升到一个新的阶段。固有免疫系统在多种疾病中的角色定位和其纷繁复杂的调节控制网络已逐步成为新的研究热点。肝脏中分布着为数众多的固有免疫细胞,现已证实固有免疫系统激活在非酒精性脂肪性肝病、缺血再灌注损伤、急性肝功能衰竭和肝脏恶性肿瘤等多种肝脏疾病中均扮演重要角色。其中炎症体的发现是证实固有免疫参与肝脏疾病的备受注重的热点之一。作为一种多存在于胞浆中的多种蛋白插件(包括NOD样受体家族等多种受体)聚集、拼接而成的大分子,炎症体当感知到部分相应的内在性或外在性病理生理信号刺激(如氧化应激刺激等)时可发生聚合、重构和活化,作为一个大的分子平台成为炎症反应的核心场所,促使诸多促炎因子在此成熟并发生局部反馈诱发级联反应。作为固有免疫系统“新晋”的核心成员之一,炎症体的角色功能包括有效清除外源性病原体及内源性应激产物、维持代谢稳态等。因此,通常在生理情况下,其具有感知、识别及清除衰老、异常物质的自我保卫作用。但是在病理情况下,其发生过度激活引发感知识别障碍及平衡失控而引起的过度清除即可诱发并加重炎症及组织破坏。虽然NLRP3炎症体在诸多疾病发展进程中的角色定位及网络调节模式逐渐为人所知,但迄今,针对能够在酒精性肝病中调节固有免疫反应的药物研究相对较少。作为有着悠久酒文化的国家,我国受ALD困扰者众多,但ALD的治疗缺面临着“传统药物疗效有限、新型药物后继无力”的尴尬窘境,临床需求缺口巨大。对肝脏固有免疫系统以往模糊认知的逐渐深入,开启了我们对于酒精性肝病这项疾病发病机制认知的新纪元。既往的相关研究表明,创伤性的酒精摄入所引发的肝内氧化应激刺激及组织的过度炎症反应是ALD中公认的两大致病机制。而肝内固有免疫网络中的NLRP3炎症体具有感知病理刺激信号并促进炎症反应的作用,因此其具备作为连接氧化应激反应及炎症反应的桥梁的潜在可能性。而能够抑制NLRP3炎症体过度活化的药物则可能为研发针对酒精性肝病更为有效的新型治疗药物提供新的方向和选择。因此,本试验意在探讨:1、槲皮素作为一种植物性的抗氧化物,其是否会影响急性酒精性肝损伤中氧化应激所造成的肝脏创伤;2、槲皮素对急性酒精刺激所引起的肝脏促炎—抗炎因子失衡有何影响,其是否会影响急性酒精损伤所引发的肝脏NLRP3炎症体过度活化;3、槲皮素的抗氧化应激作用与其对NLRP3炎症体活化程度及促炎因子释放水平的影响是否存在交互关系,并探讨此两种表型间交叉对话的关键环节及调控模式,以期探索急性酒精性肝损伤(acute alcoholic liver injury,AALI)中NLRP3炎症体调控方式的细化机制,为寻找新的防治方向和思路提供新的线索。方法:第一部分:通过GEO数据库(Gene Expression Omnibus datasets)分析和建立动物模型检测人类酒精性肝炎及急性酒精性肝损伤大鼠中具有抗氧化作用的血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)的表达差异。建立AALI动物模型,分设正常对照组、槲皮素药物对照组、AALI模型组、槲皮素药物治疗组及槲皮素+ZnppIX(HO-1抑制剂)组共5组大鼠。取各组实验大鼠的肝脏组织进行切片及HE染色后进行双盲的病理学评分以评估动物模型的有效性及各实验组间的组织病理学改变的组间差异。在各组实验动物中,通过ELISA、PCR及Western blot等方法检测并比较不同组大鼠核转录因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2 related factor 2,Nrf2)/HO-1轴的表达差异及槲皮素对AALI激发的丙二醛(malonaldehyde,MDA)及活性氧类自由基(reactive oxygen species,ROS)等应激产物水平的影响。第二部分:在动物模型中,验证槲皮素对AALI中肝脏固有免疫系统两大重要组分,即促炎-抗炎因子平衡及NLRP3炎症体的具体效应。通过ELISA方法检测正常对照组、槲皮素药物对照组、急性酒精模型组、槲皮素药物治疗组及槲皮素+ZnppIX(HO-1抑制剂)组大鼠血清及肝脏中IL-1β、IL-18及TNF-α等促炎因子及IL-10抗炎因子表达水平。此外还分别检测上述分组大鼠肝脏中炎症体组成成分NLRP3、ASC及caspase-1的mRNA及蛋白表达水平。第三部分:探讨在AALI中槲皮素的抗氧化应激表型与其调节抗炎表型二者之间是否存在交叉对话。分别在NCBI、KEGG及Reactome网站对HMOX1基因进行GO分析及通路分析。通过ELISA法检测正常对照组、槲皮素药物对照组、急性酒精性肝损伤模型组、槲皮素药物治疗组及槲皮素+Znpp(HO-1抑制剂)组中NF-κB转录因子的活性。结果:1、GEO数据库数据分析结果显示,酒精性肝炎患者HMOX1基因的表达较比对照者明显下降,二者差别明显(p0.05)。2、本实验动物模型组大鼠肝脏组织病理学改变符合酒精性肝病的病理特征,酒精模型组动物肝组织病理评分显著升高,血清肝酶学水平明显高于正常对照组(p0.05)。3、槲皮素药物治疗组的Nrf2及HO-1的mRNA表达水平及HO-1的蛋白表达水平明显高于对照组及AALI组(p0.05);HO-1抑制剂ZnppIX可有效抑制槲皮素对HO-1的诱导,表现为当槲皮素联合应用ZnppIX后HO-1的mRNA及蛋白表达水平均降低(p0.05)。4、与正常对照组相比,酒精模型组大鼠血清及肝脏组织中的MDA水平均明显升高(p0.05),其肝脏组织中的ROS水平亦明显升高(p0.05)、具有还原特性的物质GSH-Px的活性显著下降(p0.05)。与AALI组相比,槲皮素药物治疗组血清及肝脏组织中的MDA水平均明显下降(p0.05),其肝脏组织中的ROS水平亦显著降低(p0.05)、GSH-Px活性明显升高(p0.05)。当槲皮素联合应用ZnppIX后,该组大鼠血清及肝脏组织中的MDA水平较槲皮素治疗组明显升高(p0.05),肝脏组织中的ROS水平明显升高(p0.05),GSH-Px活性明显降低(p0.05)。5、与正常对照组相比,AALI组大鼠在发生创伤性酒精刺激后血清中TNF-α、IL-1β及IL-18等促炎因子水平均明显提升(p0.05),其血清中的抗炎因子IL-10水平较正常组无明显差异(p0.05)。与AALI模型组相比,槲皮素药物治疗组大鼠血清中的TNF-α、IL-1β及IL-18等促炎因子水平均明显降低(p0.05),而其血清中的抗炎成分水平明显升高(p0.05)。当槲皮素联合应用ZnppIX后,该组大鼠血清中的TNF-α、IL-1β及IL-18等促炎因子水平较槲皮素药物治疗组明显升高(p0.05),而抗炎因子IL-10分泌水平并未受到ZnppIX影响。6、与正常对照组相比,AALI模型组大鼠肝脏组织中的NLRP3炎症体三大基础组分相应基因的mRNA转录及蛋白表达水平均明显升高(p0.05)。槲皮素药物治疗组大鼠肝脏中上述基因的转录及蛋白表达水平均明显低于AALI模型组(p0.05),但槲皮素联合使用ZnppIX后前述3种基因的转录及蛋白表达水平较比单纯槲皮素治疗组再次升高。7、HMOX1的GO分析和通路分析表明HO-1可能参与白介素家族的信号传导及核转录因子NF-κβ的调控。8、与正常对照组相比,酒精模型组大鼠肝脏组织中NF-κβp65的活性明显升高(p0.05)。槲皮素药物治疗组大鼠肝脏组织中该指标的活性程度明显低于AALI组(p0.05),而槲皮素联合应用ZnppIX后大鼠肝脏组织中的NF-κβp65再次升高。结论:1、酒精性肝炎患者与对照者相比,二者存在编码HO-1蛋白的HMOX1基因的表达差异,酒精性肝炎患者存在HMOX1基因表达水平下调。2、本实验中的AALI模型组大鼠肝脏呈现出AALI典型的肝脏组织及酶学特征、建模有效,槲皮素可通过活化Nrf2/HO-1轴增加AALI时具有抗氧化作用特性的HO-1蛋白的表达。ZnppIX能够抑制槲皮素的此种HO-1诱导作用,导致槲皮素+ZnppIX组大鼠HO-1表达无明显增加。3、单纯药物治疗组中药物诱导HO-1水平增加,降低AALI时的氧化应激程度。AALI中槲皮素的此种抗氧化保护作用具有HO-1依赖性。4、槲皮素可下调AALI中炎性物质的分泌,且其抗炎作用具有HO-1依赖性;同时槲皮素可提高抗炎物质IL-10的表达水平,但此种作用独立于其对HO-1的表达诱导。即HO-1会影响槲皮素对促炎因子的抑制,但不影响其对抗炎因子的调控。5、槲皮素可降低AALI中炎症体3大基础构成蛋白的过度表达,且其机制与HO-1有关。6、AALI中槲皮素发挥保肝作用涉及的两大表型——抗氧化与抗炎表型二者间存在交叉对话,其可能机制为槲皮素通过活化Nrf2/HO-1轴诱导并增加HO-1表达,降低自由基等损伤产物水平,从而降低核转录因子NF-κB的活性、下调炎症体相关基因的表达水平,最终下调促炎物质的释放。
【图文】：
图 1.1 GSE28619 中对照者和酒精性肝炎者 HMOX1 基因表达强度 1.1 所示，在 GSE28619 研究中，对照组的 HMOX1 基因相对表 0.4663（n=7），而酒精性肝炎组的 HMOX1 基因相对表达强度为（n=15）。酒精性肝炎患者组编码 HO-1 蛋白的 HMOX1 基因的 m对照者组。物肝脏组织病理学评分前述的取材方法取得各组大鼠灌流后的洁净肝脏组织并固定后，片的制备。所有切片制备完毕后，按照双盲法参照 Knodell（HA染色后的切片进行病理活动指数评分（具体评分方式为前文所述分后取均值作为最后分数）。1.2 各实验组切片病理评价得分表（Mean±SD）别 组织病理评分
图 1.2 各个实验组大鼠肝组织切片病理评分分值分布图（*P<0.05）得出各组各只大鼠切片的分值后，绘制成图 1.2 的直方图。由图可见，病理评分分数在槲皮素药物对照组与正常对照组无明显差异、均较低。而 AALI 急性创伤模型组、槲皮素治疗组及槲皮素+ZnppIX 组的评分分值依次为显著升高、轻度升高和显著升高。其中槲皮素药物治疗组结果明显优于其他组别大鼠。在槲皮素治疗中的组织切片中可见肝细胞内的脂质沉积及炎性细胞浸润等 ALD 特征性改变明显减轻。但是当槲皮素+ZnppIX 联用时，该组切片的病理改变及评分与模型组近似（P＞0.05），可见大量细胞肿胀、其内存在较多的脂质沉积。3.3 动物肝脏病理组织学改变在 B 组槲皮素药物对照组中，单纯使用槲皮素灌胃并没有改变该组大鼠肝组织的正常结构，，和 A 组正常对照组一样，该组大鼠的组织切片中可见细胞正常无肿胀等异常表现。相对照的，在 C 组 AALI 酒精模型组中的切片中肝小叶结构虽
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R575
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本文编号：
2634618
