应用感染性丙型肝炎病毒细胞模型研究其病毒颗粒组份和干扰素omega的体外抗病毒作用

发布时间：2020-04-20 14:04

【摘要】： 背景自1989年丙型肝炎病毒克隆发现以来,丙型肝炎病毒的研究一直受制于研究模型的缺乏,利用黑猩猩动物模型作为研究手段存在诸多方面的限制,小动物模型因丙型肝炎病毒的严格宿主特异性目前不可获得,因此构建一个简单易行的细胞模型系统对丙型肝炎病毒的研究无疑会起到巨大的推动作用。1999年,Lohmann试验小组构建成功的亚基因复制子是丙型肝炎病毒细胞模型研究的一个重要里程碑,该系统可以研究丙型肝炎病毒RNA的复制机制,但对于丙型肝炎病毒与细胞受体之间的关系研究不能提供帮助,随后出现的丙型肝炎病毒假病毒颗粒虽部分促进了宿主受体探索研究,但始终不能完整模拟丙型肝炎病毒的生活周期。2005年底,美国四个实验小组几乎同时报道了可产生大量有感染性丙型肝炎病毒的细胞模型系统,该系统的构建成功得益于一基因型2a的丙型肝炎病毒病毒株的发现——JFH1,根据该病毒株的cDNA序列体外构建的亚基因复制子不需引入顺应性突变即可大量复制。实验人员通过基因克隆技术通过转染该病毒株的RNA或cDNA至易感细胞,得到具有感染性的丙型肝炎病毒颗粒。此细胞模型系统可产生大量的具有感染性的丙型肝炎病毒,对体外研究病毒的组成,生活周期,致病机制及抗病毒药物的筛选提供了一个简易有效的平台。 目的构建可产生有感染性丙型肝炎病毒的细胞模型,在此模型的基础上研究丙型肝炎病毒的理化特性,组成成分及干扰素omega抑制丙型肝炎病毒的作用。 方法将利用基因克隆技术得到的JFH1丙型肝炎病毒全长RNA通过脂质体转染至Huh7.5细胞内,常规传代培养转染细胞,在不同的时间点留取细胞培养上清、细胞总RNA及总蛋白,分别通过核酶保护分析法及蛋白印迹法检测转染后不同时间点转染细胞内丙型肝炎病毒RNA的量及丙型肝炎病毒蛋白的表达水平,同时用留取培养上清再感染Huh7.5细胞,检测转染细胞上清的感染性,证实该方法可产生有感染性丙型肝炎病毒颗粒。在此模型基础上获得大量含感染性丙型肝炎病毒颗粒的上清,经浓缩纯化后,进行蔗糖密度梯度离心,检测体外获得的含丙型肝炎病毒RNA颗粒的颗粒密度,并用蛋白印迹法探讨丙型肝炎病毒颗粒的组成成分。同时利用此模型及丙型肝炎病毒基因型1b的亚基因复制子系统研究干扰素omega的抗病毒作用,用含不同浓度干扰素omega的培基孵育细胞3天后检测细胞内丙型肝炎病毒RNA及蛋白的水平,以干扰素α-2a为对照,检测细胞内丙型肝炎病毒RNA及蛋白的水平,同时检测细胞内磷酸化的STAT1的水平。 结果通过脂质体转染技术可将全长丙型肝炎病毒RNA转染至易感细胞内,经培养传代约2周,转染细胞内可检测到丙型肝炎病毒蛋白的表达,转染细胞上清再感染易感细胞,可致被感染细胞表达丙型肝炎病毒蛋白及RNA,说明转染细胞上清含有有感染性的丙型肝炎病毒颗粒,证实该系统可作为产生有感染性的丙型肝炎病毒的细胞模型。在此细胞模型基础上,我们发现含丙型肝炎病毒RNA的颗粒密度分布广泛,在1.08-1.176g/ml之间,而且低密度颗粒的感染性高于高密度颗粒,在含丙型肝炎病毒RNA的颗粒中可以检测到apoE蛋白的存在,提示apoE为病毒颗粒的组成成分;同时在含丙型肝炎病毒RNA的颗粒中,我们同样可以检测到病毒的NS2,NS3,NS4B,NS5A蛋白,这提示上述蛋白亦可能为病毒的组成成分。最后,利用丙型肝炎病毒基因型1b的亚基因复制子系统及丙型肝炎病毒的细胞培养模型,我们证实omega干扰素同样具有很强的抗病毒作用,两种干扰素处理后细胞内丙型肝炎病毒的RNA和蛋白的水平较空白对照组均明显下降,p＜0.05,且未发现细胞毒性;与相同浓度的干扰素a—2a比较,omega干扰素处理组细胞内蛋白浓度明显较干扰素a—2a处理组为低,其差异具有统计学意义(p＜0.05);而且比较两种干扰素对丙型肝炎病毒RNA抑制作用的EC50,omega干扰素的EC50较a—2a干扰素约低10倍。在丙型肝炎病毒的细胞培养模型基础上,两种干扰素处理感染性模型系统后上清感染性均较对照组减弱,p＜0.05;同样的,omega干扰素处理组的感染性下降得较a—2a干扰素处理组更为明显,p＜0.05。两种干扰素处理后细胞内磷酸化的STAT1的水平均较对照组为高,p＜0.05;而且omega干扰素处理组较a—2a干扰素处理组升高得更为明显,p＜0.05。 结论1.可通过脂质体转染技术成功将约10kb的丙型肝炎病毒(JFH1病毒株)全长RNA转染入Huh7.5细胞。2.JFH1病毒株病毒RNA转染后可在细胞中自我复制、翻译表达丙型肝炎病毒特异性蛋白;同时可获得有感染性的丙型肝炎病毒颗粒的培养上清。3.体外培养获得的含丙型肝炎病毒RNA的颗粒以多种密度形式存在,且以低密度为主。低密度病毒颗粒的感染性高于高密度病毒颗粒。4.apoE存在于某些含丙型肝炎病毒RNA的颗粒中,其含量的多少与丙型肝炎病毒颗粒的感染性高低存在良好的正相关关系。5.除外结构蛋白,部分传统意义上的非结构蛋白包括NS2、NS3、NS4B、NS5A亦可在HCV病毒颗粒中检测到,其生物学意义有待进一步研究。6.干扰素omega具有抑制丙型肝炎病毒基因型1b及2a病毒复制的作用,且与干扰素α-2a比较,其抗病毒活性强于干扰素α-2a,原因可能与其激活干扰素受体的能力更强有关。
【图文】：

CFig18DeetiontheHCVRNAlevelofHCVeeinfeetedeellstreatedwithIFN.(A)and(B)showedtheRpAresulttreatedwithIFNa一ZaandIFNo.(C)showedthedrug一effeeteurveofIFNbasedonthequantitationofintracellularHCVRNA.图18RPA检测干扰素处理后HCVc。感染细胞内HCV-RNA水平。(A)和(B)分别显示了RPA检测IFNa一2a和IFN。干预后细胞内HCvRNA的水平变化。(C)示两种干扰素对HCVRNA抑制的药效曲线。3.IFN。与IFNa一Za的干预对培养上清再感染性的影响(1)westemblot检测再感染细胞内HCV蛋白的表达从图19的A和B可以看出，随着IFN浓度的升高，NS3的信号渐减弱，说明细胞内NS3蛋白的表达减少，定量比较蛋白浓度的变化，，IFNa一2a在浓度全4留ml时，与对照组之间的差异具有统计学意义，p<0.05;IFN。在浓度全0.8川ml时，与对照组之间的差异具有统计学意义，p<0.05。图c定量比较相同活性单位的IFN。与IFNa一Za对蛋白表达信号的影响，可以看出相同活性单位下，IFN。干预

博士学位论文第三章(2)IFA检测再感染细胞内NS3蛋白的表达图20直观的显示了经干扰素处理得到的上清的再感染性变化，红色HCVNs3蛋白，胞核蓝染，Ns3蛋白的表达在胞浆，信号的多少和强弱细胞内蛋白表达的水平。与westemblot的结果一致，经千扰素处理后细再感染Huh7.5细胞，细胞内蛋白信号减少、减弱，而且，比较相同活性干扰素。和价Za，前者的抑制强度高于后者。(图20)下NQZa!FN切
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R512.63

【共引文献】

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本文编号：2634622