MLCK在实验性高甘油三脂血症性胰腺炎胰腺导管上皮细胞中作用的初步研究

发布时间：2020-04-25 06:48

【摘要】：据统计,高甘油三脂血症性胰腺炎(hypertriglyceridemia pancreatitis,HTGP)近年来已成为我国急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)的第三大病因,但其发病机制至今尚未阐明。高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia,HTG)时游离脂肪酸(free fatty acids,FFAs)对胰腺腺泡细胞的毒性作用和细胞钙内超载导致的腺泡细胞损伤是目前公认的HTGP发病机制。但以上研究均聚焦于胰腺腺泡细胞。胰腺导管上皮细胞及其分泌物构成了一特殊结构-胰管黏膜屏障(pancreatic ductal mucosa barrier,PDMB)。同时,胰腺导管上皮细胞延伸至腺泡腔与腺泡细胞相邻。本课题组前期的动物实验表明:在雨蛙肽腹腔注射诱导的HTGP大鼠AP模型胰腺组织中肌球蛋白轻链激酶(myosin light-chain kinase,MLCK),L型钙离子通道Cav1.2表达上调及紧密连接(tight junction,TJ)改变[1,2],结合文献报道:高甘油三酯血症大鼠模型中胰腺腺泡细胞无明显脂肪变[3]。我们推测FFAs可能通过对胰腺导管上皮细胞及其构成的PDMB产生损伤而导致HTGP发病。而MLCK,Ca2+通道及TJ是否参与其中?本文将展开初步研究。第一部分高脂环境对胰腺导管上皮细胞MLCK及细胞间紧密连接的影响目的:用油酸(oleic acid,OA)和软脂酸(palmitic acid,PA)与HPDE6C7细胞共培养,模拟体内的高脂环境,观察在高脂环境下HPDE6C7细胞中MLCK,TJ相关蛋白和Ca2+通道mRNA的表达水平变化。方法:分别用不同浓度的OA(100,200,300,400,500μM/L)和PA(100,200,300,400,500μM/L)处理HPDE6C7细胞24h。采用CCK-8法检测细胞增殖;q PCR法检测MLCK、ZO-1、Claudin-2、Occludin、Cav1.2、Cav1.3、Cav2.1、Cav2.2、Cav3.1、Cav3.2的mRNA表达水平。结果:1.(1)OA:在浓度为300μM,400μM和500μM时抑制HPDE6增殖,以500μM时抑制最明显(P0.05)。(2)PA:在浓度为200μM,300μM,400μM和500μM时抑制HPDE6增殖,以500μM时抑制最明显(P0.05)。2.(1)OA:在浓度为400μM增加MLCK mRNA表达(P0.05);浓度为300μM时抑制Occludin mRNA表达(P0.05);不同浓度OA均抑制ZO-1 mRNA表达(P0.05),且对Claudin-2 mRNA表达无影响(P0.05)。(2)PA:增加MLCK mRNA表达,呈浓度依赖性(P0.05);PA在浓度为200μM时抑制Claudin-2和Occludin mRNA表达(P0.05);在浓度为100μM-300μM抑制ZO-1 mRNA表达(P0.05)。3.(1)OA:浓度在400μM和500μM时增加Cav2.2 mRNA表达(P0.05);OA浓度在300μM,400μM和500μM时增加Cav1.2、Cav1.3、Cav2.1、Cav3.1mRNA表达(P0.05);不同浓度OA对Cav3.2无影响(P0.05)。(2)PA:浓度在200μM和500μM增加Cav1.2和Cav2.1 mRNA表达(P0.05);PA浓度在300μM,400μM和500μM时增加Cav2.2和Cav3.2 mRNA表达(P0.05);PA浓度在200μM,300μM,400μM和500μM时增加Cav1.3和Cav3.1mRNA表达(P0.05)。结论:1.OA和PA抑制人胰腺导管上皮细胞系HPDE6C7细胞增殖,以500μM时抑制作用最明显。2.OA和PA上调HPDE6C7细胞中MLCK及Cav1.2、Cav1.3、Cav2.1、Cav2.2、Cav3.1 mRNA表达,减少ZO-1、Occludin和Claudin-2 mRNA表达。第二部分MLCK在雨蛙肽诱导的HTGP胰腺导管上皮细胞模型中的表达变化目的:用雨蛙肽(caerulin,CAE)刺激与PA共培养的HPDE6C7细胞,模拟体内HTGP的发病过程,结合ML-7干预。观察上述条件对细胞中MLCK,TJ相关蛋白和Ca2+通道的影响。方法:用浓度为200μM的PA与HPDE6C7细胞共培养24h后加入CAE和ML-7预处理。用q PCR检测MLCK、ZO-1、Claudin-2、Occludin、Cav1.2、Cav1.3的mRNA表达水平。Western Blot法检测MLCK、ZO-1、Claudin-2和Occludin蛋白表达水平。FITC-Dextran法检测单层HPDE6C7细胞通透性。直接免疫荧光法观察细胞微丝结构。结果:1.与PA共培养时:MLCK蛋白和mRNA表达上调,Cav1.2和Cav1.3mRNA表达上调;ZO-1、Claudin-2、Occludin蛋白和mRNA表达减少,(P0.05);HPDE6C7细胞通透性增高,局部微丝排列紊乱。2.CAE刺激后:MLCK蛋白和mRNA表达继续上调,与PA组比较,有统计学意义(P0.05)。ZO-1、Claudin-2和Occludin mRNA表达减少,与control组比较,有统计学意义(P0.05);与PA组比较,Claudin-2 mRNA表达减少,有统计学意义(P0.05)。Cav1.2和Cav1.3 mRNA上调,但与PA组比较无统计学意义(P0.05)。ZO-1、Claudin-2和Occludin蛋白表达表达下调,与control组比较,有统计学意义(P0.05),其中ZO-1和Occludin蛋白表达下调,与PA组比较有统计学意义(P0.05)。单层HPDE6C7细胞通透性增高,正常微丝结构破坏,微丝解聚,网状结构坍塌。3.ML-7干预组:MLCK蛋白和mRNA表达减少,与PA+CAE组比较,有统计学意义(P0.05)。Cav1.2和Cav1.3 mRNA表达与PA+CAE组两两比较,无统计学意义(P0.05)。ZO-1、Claudin-2和Occludin蛋白和mRNA表达上调,其中ZO-1与Occludin蛋白和mRNA上调与PA+CAE组比较,有统计学意义(P0.05)。HPDE6C7细胞通透性降低,微丝结构排列紊乱,破坏程度较PA+CEA组轻。结论:1.CAE导致高脂环境下HPDE6C7细胞MLCK蛋白和mRNA表达增多,ZO-1、Claudin-2、Occludin蛋白和mRNA表达减少,微丝正常结构破坏,细胞通透性增高。2.MLCK抑制剂可改善CAE刺激后高脂环境下HPDE6C7细胞微丝结构破坏,增加ZO-1、Claudin-2、Occludin蛋白和mRNA表达,降低细胞通透性。3.PA和PA+CEA均能上调Cav1.2和Cav1.3 mRNA表达,但两者相比无统计学意义,ML-7对此无抑制作用。第三部分干扰MLCK基因对HTGP胰腺导管上皮细胞通透性及紧密连接影响的初步研究目的:使用慢病毒介导的RNA干扰技术,对人胰腺导管上皮细胞系HPDE6C7细胞的MLCK基因进行mi RNA干扰,构建带EGFP报告基因的慢病毒载体;用构建的MLCK-mi RNA载体转染HPDE6C7细胞,形成稳定转染的细胞系,并与PA和CAE共培养,观察单层胰腺导管上皮细胞通透性及TJ相关蛋白表达变化。方法:1.克隆人源MLCK基因,连接到经Asc I和Pme I酶切后p Lenti6.3-EGFP载体上,构建p Lenti6.3-EGFP-MLCK重组质粒,转染293T细胞,包装慢病毒;用慢病毒感染人胰腺导管上皮细胞系HPDE6C7,杀瘟稻素(blasticidin,BSD)筛选稳转细胞株,q PCR验证转染效果。2.将筛选成功的MLCK-mir-HPDE6C7细胞与空载慢病毒的阴性对照组和正常HPDE6C7细胞与PA共培养,CAE刺激后用Western Blot法检测MLCK、ZO-1、Claudin-2和Occludin蛋白表达水平。FITC-Dextran法检测单层HPDE6C7细胞通透性。结果:1.经测序鉴定证实成功构建人源MLCK基因的mi RNA慢病毒干扰载体及重组质粒;共转染293T细胞产生的重组慢病毒颗粒感染HPDE6C7细胞后高表达绿色荧光;BSD筛选14天q PCR显示mi RNA慢病毒转染组MLCK mRNA表达较空白对照组和阴性对照组明显下降(P0.05);2.L+PA组和L+PA+CEA组中MLCK蛋白表达较其他组低,有统计学意义(P0.05);3.与control组相比,LNC+PA组和LNC+PA+CEA组中MLCK蛋白表达升高,细胞通透性升高,Claudin-2、Occludin、ZO-1蛋白表达降低,有统计学意义(P0.05)。4.与LNC+PA+CEA组相比,L+PA组和(或)L+PA+CEA组中Claudin-2、Occludin、ZO-1蛋白表达升高,细胞通透性降低(P0.05),有统计学意义。结论:1.成功建立稳定干扰MLCK基因的HPDE6C7细胞系。2.干扰HPDE6C7细胞MLCK基因表达后,HTGP胰腺导管上皮细胞模型通透性降低,TJ相关蛋白表达上调。
【图文】：

（1）OA在浓度为100μM和200μM对HPDE6C7细胞无抑制增殖作用（P＞0.05）；在浓度为300μM，400μM和500μM时均可抑制HPDE6C7增殖，以500μM时抑制最明显（P＜0.05），见图1-1A。（2）PA在浓度为100μM时对HPDE6C7细胞无抑制增殖作用（P＞0.05）；在浓度为200μM，300μM，400μM和500μM时均可抑制HPDE6C7增殖，，以500μM时抑制最明显（P＜0.05），见图1-1B。图1-1油酸和软脂酸对HPDEC7细胞增殖的抑制A.不同浓度油酸对HPDEC7细胞增殖的抑制 B. 不同浓度软脂酸对HPDEC7细胞增殖的抑制Fig 1-1 Inhibition effects of oleic acid and palmitic acid on HPDEC7A. Inhibition effects of different concentration of oleic acid；B.Inhibition effects of different concentrationof palmitic acid* vs control group P＜0.05真努力奋斗才能梦想成真努力奋斗才能梦想成真努力奋斗才能梦想成真努力奋斗才能梦想成真努力奋斗才能梦想成真努力奋斗才能梦想成真努力奋斗?

腺炎胰腺导管上皮细胞中作用的初步研究 博士学位论文34图1-3 油酸和软脂酸对Ca2+通道 mRNA表达影响A、C、E、G、I、K:油酸对Cav1.2、Cav1.3、Cav2.2、cav2.1、Cav3.1、Cav3.2 mRNA表达影响B、D、F、H、J、L:软脂酸对Cav1.2、Cav1
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R576

【参考文献】

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本文编号：2639933