Alamandine通过调控氧化应激和自噬影响肝纤维化的作用及机制

发布时间：2020-04-25 07:25

【摘要】：研究背景肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)被认为是参与肝纤维化最关键的细胞。局部组织的肾素-血管紧张素系统(Renin-Angiotensin-System,RAS)与肝纤维化的发生发展关系密切,已证实Ang-(1-7)有拮抗AngⅡ诱导的肝纤维化作用。新发现RAS的组分alamandine,其结构与Ang-(1-7)相似,可通过受体MrgD对AngⅡ发挥负性调控作用。自噬(autophagy)为HSC活化供能,促进HSC向肌成纤维细胞转化并分泌细胞外基质;活性氧(ROS)作为氧化应激(oxidative stress)的主要产物,是目前公认的自噬诱导剂之一。因此,alamandine是否能通过调控氧化应激和自噬,进而对肝纤维化产生影响,是本文研究的重点。目的本课题拟通过腹腔注射四氯化碳的方法构建大鼠肝纤维化模型,予持续alamandine腹腔泵入治疗,探讨alamandine对大鼠肝纤维化的总体作用以及组织中氧化应激和自噬的影响。通过进一步体外研究alamandine对大鼠原代HSC内氧化应激及自噬的影响,明确肝纤维化的可能机制,为临床干预肝纤维化提供新的靶点和策略。方法1、SD 大鼠随机分为 Vehile 组(oil 组)、cc14 组、ALA 组、ccl4+ALA 组、ccl4+3MA组、cc14+Rapa组;4周后取肝组织和血液标本。对肝组织进行HE染色、Masson染色、羟脯氨酸测定、免疫组化、Western blot、H202检测以及血液标本ALT、AST检测,评价各组氧化应激、自噬和肝纤维化水平。2、原代 HSC 分为对照组、AngⅡ组、alamandine 组、AngⅡ+ alamandine组。qRT-PCR和Western blot检测细胞内RAS组分表达水平变化。3、探索alamandine对AngⅡ诱导的HSC活化和胶原生成的影响,Western blot检测细胞内COL1A、α-SMA和CTGF等胶原相关蛋白表达水平。用MrgD受体抑制剂D-Pro7-Ang-(1-7)、MrgD受体激动剂β-alanine以及MrgD siRNA抑制或者刺激MrgD受体后,检测胶原相关蛋白表达水平。4、探索alamandine对AngⅡ诱导的氧化应激的影响,Western blot检测NOX4蛋白表达水平,酶标仪检测ROS含量,H202试剂盒检测H2O2的含量,Transwell实验检测HSC的迁移情况。分别用NOX4 siRNA和MrgD siRNA转染HSC后,Western blot检测NOX4和胶原相关蛋白表达水平。5、探索AngⅡ和alamandine对HSC自噬的调控,Western blot检测细胞内自噬通路蛋白表达水平,透射电子显微镜(TEM)检测细胞内自噬体情况,mRFP-GFP-LC3腺病毒转染HSC后共聚焦显微镜观察自噬流情况,LC3 siRNA和NOX4 siRNA转染HSC后检测自噬蛋白和胶原相关蛋白表达水平。结果1、与对照组(Vehile组)相比,ccl4组肝内氧化应激、自噬、肝纤维化指标均显著增高;与cc14组相比,ccl4+ALA组和ccl4+3MA组肝内氧化应激、自噬、肝纤维化指标均明显降低;与ccl4组大鼠相比,cc14+Rapa组肝内氧化应激、自噬、肝纤维化指标均有增高。2、Ang Ⅱ刺激后,原代HSC内ACE和AT1R的表达明显升高,ACE2和MrgD的表达降低;alamandine刺激后,原代HSC内ACE2和MrgD的表达明显升高,ACE和AT1R的表达降低。3、Alamandine与Ang-(1-7)作用相似,均可抑制AngⅡ诱导的原代HSC活化和胶原生成;而这一抑制作用被alamandine的受体MrgD阻断剂D-Pro7-Ang-(1-7)解除,但不能被MAS受体阻断剂A779解除。MrgD受体激动剂β-alanine亦能抑制AngⅡ诱导的HSC活化和胶原生成。MrgD受体被siRNA沉默后,alamandine以及β-alanine都不能抑制AngⅡ的诱导作用。4、Alamandine抑制AngⅡ诱导的HSC内ROS、H202生成和NOX4蛋白表达。抗氧化剂NAC和NOX4抑制剂VAS2870亦可抑制Ang Ⅱ的诱导作用。干扰NOX4或者MrgD后,NOX4、COL1A、α-SMA和CTGF的蛋白表达水平显著降低。5、透射电镜、自噬流和Western blot结果均提示:AngⅡ刺激后HSC内自噬水平明显增加;alamandine可抑制AngⅡ诱导的HSC自噬激活,而这一抑制作用被D-Pro7-Ang-(1-7)解除。NAC和VAS2870亦可抑制Ang Ⅱ诱导的自噬水平升高。干扰LC3或者NOX4后,HSC内自噬水平降低,HSC活化和胶原生成被抑制。结论1.外源性持续腹腔泵入alamandine能够抑制四氯化碳诱导的肝纤维化,并能减轻肝组织氧化应激和自噬水平。2.AngⅡ通过诱导由NOX4介导的ROS生成激活HSC自噬,促进HSC活化和胶原生成。3.Alamandine通过抑制NOX4介导的ROS生成调控HSC自噬,阻断AngⅡ的诱导作用。4.结合已有文献报道及本课题研究结果,我们推断在alamandine影响肝纤维化的作用机制中,可能存在如下信号转导通路(如图):
【图文】：

结果轻。逡逑－１－１邋Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｐｉｃｔｕｒｅｓ邋ｏｆ邋ｌｉｖｅｒ邋ｓｅｃｔｉｏｎｓ邋ｆｒｏｍ邋Ｖｅｈｉｃｌｅ，邋ｃｃｌ４，邋ＡＬＡ，邋ｃｃｌ４邋ｐｌｕｓ邋Ａ３ＭＡ邋ａｎｄ邋ｃｃｌ４邋ｐｌｕｓ邋Ｒａｐａ邋ｓｔａｉｎｅｄ邋ｗｉｔｈ邋Ｈ＆Ｅ（Ｏｒｉｇｉｎａｌ邋ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ：邋ｘ２００）．邋Ｔｈｅｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｗａｓ邋ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ邋ｉｎ邋ｖｅｈｉｃｌｅ邋ｇｒｏｕｐ邋ａｎｄ邋ＡＬＡ邋ｇｒｏｕｐ，邋ｗｉｔｈｏｕｔ邋ｉｎｆｌａｍｍａｔａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｃｏｌｌａｇｅｎ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．邋Ｔｈｅ邋ｈｅｐａｔｉｃ邋ｌｏｂｕｌｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｗａｓ邋ｄａｍａｇｅｄ邋ｉｎ邋ｃｃｌ４邋ｇＲａｐａ邋ｇｒｏｕｐ，邋ｗｉｔｈ邋ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｃｏｌｌａｇｅｎ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，邋ｅｓｐｅｌ邋ａｒｅａ．邋Ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｃｃｌ４邋ｇｒｏｕｐ，邋ｔｈｅ邋ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ｈｅｐａｔｉｃ邋ｌｏｂｕｌｅ邋ｗｅｓ邋ｉｎ邋ｃｃｌ４＋Ｒａｐａ邋ｇｒｏｕｐ．邋Ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｃｃｌ４邋ｇｒｏｕｐ，邋ｔｈｅ邋ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆｅ邋ｗｅｒｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ邋ｌｉｇｈｔｅｎｅｄ邋ｉｎ邋ｃｃｌ４＋ＡＬＡ邋ｇｒｏｕｐ邋ａｎｄ邋ｃｃｌ４＋３ＭＡ邋ｇｒｏｕｐ．逡逑Ｖｅｅ逡逑

ＩＨＳＡＫ逦Ｍｅｔａｖｉｒ逡逑图１－１－２．各组肝组织肝纤维化丨ＳＨＡＫ评分和Ｍｅｔａｖｉｒ评分。结果提示：与Ｖｅｈｉｃｌｅ组和ＡＬＡ逡逑组相比，ｃｄ４组的肝纤维化评分明显增高；而外源性持续腹腔泵入Ａｌａｍａｎｄｉｎｅ（ｃｄ４＋ＡＬＡ组）逡逑可减轻肝纤维化程度。予自噬诱导处理后，ｃｃｌ４＋Ｒａｐａ组肝纤维化评分较ｃｃｌ４组增高；而予逡逑自噬抑制处理后，ｃｃｌ４＋３ＭＡ组肝纤维化评分较ｃｃｌ４组降低（＊提示与Ｖｅｈｉｃｌｅ组相比，Ｐ＜０．０５；逡逑＃提示与ｃｃｌ４组相比，，Ｐ＜０．０５）。逡逑Ｆｉｇ．ｌ－ｌ－２．Ｔｈｅ邋ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｌｉｖｅｒ邋ｆｉｂｒｏｓｉｓ邋ｗｉｔｈ邋ＩＳＨＡＫ邋ａｎｄ邋Ｍｅｔａｖｉｒ邋ｓｃｏｒｅ．邋Ａｌｌ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ａｓｓａｙｓ逡逑ｗｅｒｅ邋ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ邋ｉｎ邋ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ．邋Ｔｈｅ邋ｄａｔａ邋ａｒｅ邋ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ邋ａｓ邋ｍｅａｎ邋土邋ＳＥＭ．邋＊ｐ＜０．０５邋ｖｅｒｓｕｓ邋Ｖｅｈｉｃｌｅ逡逑ｇｒｏｕｐ；＂邋ｐ＜０．０５邋ｖｅｒｓｕｓ邋ｔｈｅ邋ｃｃｌ４邋ｇｒｏｕｐ．逡逑１．２大鼠肝组织Ｍａｓｓｏｎ染色计算胶原面积逡逑ＳＤ邋大鼠随机分为邋Ｖｅｈｉｌｅ邋组（ｏｉｌ邋组）、ｃｃｌ４邋组、ＡＬＡ邋组、ｃｃｌ４＋ＡＬＡ邋组、ｃｃｌ４＋３ＭＡ逡逑组、ｃｃｌ４＋Ｒａｐａ组
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575

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本文编号：2639968