骨髓间充质干细胞定向分化肝细胞及其门静脉移植治疗肝纤维化的实验研究

发布时间：2020-04-26 02:43

【摘要】：目的对具有无限或较长期自我更新和多向分化潜能的干细胞及其横向分化特性的研究为各种疾病提供了新的治疗手段。骨髓中含有两类干细胞,一类是造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs),另一类是间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)。MSCs源于中胚层,具有很强的自我更新和分化能力,在适当的条件下,可以跨胚层“横向分化”为不同胚层来源的细胞如成骨细胞、神经细胞、肝系细胞等。MSCs具有两大显著优点:一方面其来源广泛,取材方便,且对身体无害;另一方面MSCs无免疫排斥反应,因而近年来已成为研究热点。生物医学领域对干细胞的研究及其取得的成果,为肝脏疾病的治疗提供了新的思路和方法。国内外研究均已证明,MSCs在体内、外均可转化为肝细胞样细胞,并具有肝细胞的合成与分泌等功能。为了探索骨髓间充质干细胞横向分化为肝细胞的作用机制,并研究这些细胞移植到肝内及其在肝内的定向分化。我们将大鼠骨髓间充质干细胞诱导为肝细胞样细胞后,将其移植到同种大鼠已纤维化的肝脏,观察其分布、分化情况,并观察对纤维化的大鼠肝功能改善的效果。方法1.无菌操作,获得3～4周龄的SD雄性大鼠四肢骨的骨髓细胞,红细胞裂解液裂解红细胞后进行贴壁培养以分离、纯化MSCs;MSCs传代4次后,免疫荧光染色法检测其表面抗原CD44、CD45和CD90的表达情况。HGF+aFGF+OSM诱导骨髓间冲质干细胞向肝细胞分化21天后,倒置相差显微镜下观察其细胞的形态、大小、细胞核数目及核浆比的变化;RT-PCR检测诱导细胞在0、7、14、21天时白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)及细胞角蛋白18(CK18)的表达情况。2.将SD雄性大鼠随机分为:正常对照组、CCL_4造模组、自发逆转组、抗逆转组。CCL_4造模组采用腹腔注射CCL_4(溶剂为橄榄油,v/v=1:1),剂量按照第一周0.2ml/100g体重,此后0.1 ml/100 g体重,每周2次,持续8周,于第4周、第6周、第8周处死并留存肝脏和血液标本。正常对照组腹腔注射橄榄油。自发逆转组造模方法与剂量同造模组,注射6周后停止,于第8周、第10周处死并留存肝脏和血液标本。抗逆转组造模也与造模组相同,注射6周,于第7周起,改为皮下注射CCL_4(橄榄油溶解,v/v=1:1),剂量分别为0.08 ml/100 g体重、0.06 ml/100 g体重、0.04 ml/100 g体重和0.02 ml/100 g体重,每周一次,于第8周、第10周处死后进行肝脏和血液标本的取材。3.肝纤维化的SD大鼠随机分为移植对照组、肝样细胞移植组。实验前6周按造模组方法构建其肝纤维化模型,后4周按抗逆转0.06组方法维持其肝纤维化状态。对照组采用门静脉输注生理盐水,移植组输入DAPI标记的诱导细胞,细胞移植后分别于第1、2、3、4周处死大鼠,留取肝脏和血清标本。4.肝组织常规HE染色、Masson三重染色,进行纤维化程度的分期评估和纤维化的半定量统计分析;制作电镜标本观察超微结构改变;移植细胞后的SD大鼠肝脏制成冰冻切片,荧光显微镜观察细胞定居;全自动生化分析仪与放射免疫法分别检测血清肝功能指标(ALT、AST、ALB)和血清肝纤维化指标(HA、LN)。5.统计学分析:计量资料采用单因素方差分析,计数资料用Ridit分析,以α=0.05为检验水准,采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。结果1.显微镜下,传代4次后的间冲质干细胞形态一致,分布均一,呈梭形或纺锤形,排列具有方向性,呈漩涡状或平行状排列。免疫荧光染色结果显示:CD44与CD90染色阳性,CD45染色阴性。诱导21天时,细胞形态由异形逐渐变为类圆形、圆形的肝样细胞,有聚集趋势。RT-PCR结果提示,细胞于诱导后的第7天,AFP开始表达,第14天ALB及CK18表达。2.造模6周时,肝血窦扩张充血,肝细胞脂肪变性明显,汇管区纤维间隔增宽,小血管扩张,部分区域的肝小叶结构破坏,有假小叶形成趋势。肝细胞超微结构改变明显,细胞器数量减少,部分线粒体嵴髓样改变,可见肿胀的空泡和脂滴,肝细胞与肝血窦之间可见纤维增生,纤维排列规则。与正常组相比,纤维化分期和半定量计分有统计学差异(P＜0.05)。肝功能指标ALT、AST,肝纤维化指标HA、LN明显升高。停药后肝组织逐渐恢复正常,抗逆转0.06组肝组织纤维化的各项指标与造模组相比,差异无统计学意义(P＞0.05)。3.体内实验结果显示,移植细胞逐渐从血管进入肝脏实质,最终散布于肝细胞间,但移植3周后,荧光衰减明显。移植组第在2周时,肝组织中的假小叶逐渐吸收或消散,纤维化程度明显轻于对照组,胶原染色变浅,分布于纤维间隔和汇管区,肝细胞呈气球样变性。细胞移植后第4周肝细胞排列接近正常,偶见点状坏死,无纤维间隔。肝细胞超微结构逐渐恢复正常。细胞移植后第4周,血清肝功能指标ALT、AST、ALB,肝纤维化指标HA、LN与正常组相比,差异无统计学意义(P＞0.05)。结论1.采用裂解红细胞与贴壁培养法相结合分离、纯化MSCs,可得到活性好和纯度高的MSCs。2.在一定的微环境条件中,HGF+aFGF+OSM能够诱导大鼠MSCs分化为表达AFP、ALB、CK18的肝细胞。3.腹腔注射50%四氯化碳(每周2次),6周后能够很好的建立肝纤维化模型,但造模停止后,纤维化自发逆转,至停药4周时,肝组织结构基本恢复正常。4.腹腔注射6周后,改为皮下注射50%四氯化碳(每周1次),能维持造模的纤维化状态4周。5.诱导的肝样细胞植入纤维化的肝组织后,细胞可停留于汇管区、肝细胞索,植入细胞最早可见于移植后第7天。6.植入诱导的肝样细胞能够部分替代肝细胞的功能,延缓疾病的发展。7.骨髓MSCs诱导的肝样细胞在肝纤维化形成的肝组织中定向分化为肝细胞可被看作体内诱导。
【学位授予单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R575.2

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