Syndecan-1脱落在肠上皮细胞炎症调控中的作用

发布时间：2020-04-26 09:32

【摘要】：研究背景与目的 Syndecan-1(Sdc-1)也叫CD138,是细胞表面乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)分子,多表达于成熟上皮细胞表面,是细胞间质、细胞质膜的重要组成部分。它由跨膜的核心蛋白和连接于核心蛋白上的硫酸乙酰肝素(HS)链及硫酸软骨素(CS)链组成。它是肠屏障的组成部分,阻止致炎因素作用于肠道。完整的HS链是Syndecan-1发挥作用的主要部分,能与细胞因子、生长因子、趋化因子、细胞外基质等结合,在维持细胞形态、促进组织修复、调节免疫功能中起重要作用。Syndecan-1能与炎症中的众多粘附分子、细胞、趋化因子等结合,在炎症细胞的移动、粘附、活化等过程中发挥作用。已发现一些细菌毒力因子可通过促进Syndecan-1的胞外段脱落来增强对宿主的损伤,抑制Syndecan-1脱落可有效抑制细菌感染造成的肺部炎症[3]aSyndecan-1胞外段脱落的分子机制及其调控尚不清楚,目前认为Syndecan-1脱落由金属蛋白酶介导,多种基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)包括MMP-7、 MMP-9、 MMP-14及ADAM17等能在体外切割Syndecan-1使其释放胞外段[4-5]。近期研究发现,Syndecan-1的编码基因丙氨酸(第243位)、丝氨酸(第244位)是胞外段裂解靶点之一。改变这2个脱落位点可改变其脱落的特性。近年来,Syndecan-1胞外段脱落与消化道炎症的关系逐渐受到重视。Syndecan-1胞外段的大量破坏、脱落可激发了促炎与抑炎因子的失调,促使炎症细胞的活化、外渗并延缓了消化道黏膜上皮的再生修复。炎症性肠病(IBD)是一组肠道慢性非特异性炎性病变,病因未明,目前认为与遗传、环境因素及肠粘膜免疫异常有关。IBD在我国的发病率逐年增高,对其发病机制的探索一直是近年来的研究重点。我们既往的研究发现,葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎病情与肠黏膜Syndecan-1蛋白水平减低程度呈显著的正相关。 NF-κB是重要的核转录因子之一,它通过调控多种基因的表达而参与免疫反应、细胞增殖、细胞凋亡和肿瘤发生等过程。静息状态下,抑制蛋白IκB(inhibitor of NF-κB)使之处于非活化状态,IκB可在内毒素、TNF-α、 IL-1β、细菌、病毒等的刺激下迅速水解,使得NF-κB (P50/P65异源二聚体)激活并进入细胞核,从而调控靶基因的转录表达,其中P50与DNA结合有关,P65含有转录活化区域,负责转录激活。NF-κB在炎症的发生和持续中扮演着摘要的角色,抑制其活性可以减缓IBD的炎症进程。肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor alpha, TNF-a)是机体在感染、休克、创伤中引起细胞、组织损伤的最重要的炎性介质之一,肠道大量的细菌产生的内毒素可刺激TNF-α的合成和释放。研究证实在IBD患者粪便中TNF-α的浓度与结肠炎症的严重程度相关。TNF-α可促进核因子NF-κB进一步活化,同时使炎性因子IL-1p等表达增加,使炎症过程得以持续和放大。白介素-1β(interleukin-lβ, IL-1β)是一种强有力的前炎症细胞因子,在个体对多种抗原的侵入反应中发挥作用,它可以提高个体对各种内源性及外源性刺激的免疫力。IL-1p在与其它炎症因子如IL-6等协同作用时对炎症的影响会更为明显。IL-1β在肠道炎症时能引起粘膜屏障功能下降也已经受到人们重视。有研究报道中性粒细胞通过微血管循环进入结肠黏膜内,并持续存在于活动性UC的全过程。固有膜中的中性粒细胞被认为是病理学炎症反应的可靠标志物,中性粒细胞趋化因子(cytokine-induced neutrophil chemoattractant-1CINC-1)的作用不可忽视。Syndecan-1能与趋化因子KC等结合,形成趋化因子浓度梯度,趋化中性粒细胞向炎症部位游走。Syndecan-1还可结合于CC趋化因子,抑制该因子介导的T细胞迁移和Th2细胞积聚[10]。鉴于Syndecan-1在肠道炎症IBD发病中的重要作用。目前对Syndecan-1基因载体及其不脱落突变体均罕见报道,且它们与NF-κB信号通路及炎症因子之间的作用尚未明确。阻碍了对Syndecan-1在胃肠道疾病中具体作用的深入研究。本研究通过建立小鼠Syndecan-1的pcDNA3.0正常高表达和不脱落真核表达载体,并验证其在IEC-6、 Caco-2细胞中的表达,检测LPS刺激后不同Syndecan-1表达水平的两种细胞在NF-κB信号通路及TNF-α、 IL-1β、 CINC-1的表达水平变化。进一步探讨Syndecan-1脱落在肠道炎症中的作用机制。方法 1.从小鼠肠道组织中提取总RNA,逆转录为cDNA后作为模板,用PCR法扩增出syndecan-1分子编码序列的cDNA全长,与pcDNA3.0载体连接,构建真核表达载体pcDNA3.0-wildtype-syndecan-1(WT-sdc-1),再通过体外定点突变技术,将243位丙氨酸A突变为苏氨酸T,244位丝氨酸S突变为色氨酸W,构建真核表达载体pcDNA3.0-unshedding-syndecan-1(uS-sdc-1),并进行测序鉴定。 2.培养IEC-6、 Caco-2细胞2种细胞。分别设立阴性对照组、Vector转染组、WT-sdcl转染组及uS-sdc1转染组,转染24小时后,予1uM的佛波酯(PMA)刺激15分钟后,用RT-PCR、 Dot blot及免疫荧光从基因及蛋白水平鉴定这2株细胞中syndecan-1的表达的情况。 3.实验分组：IEC-6、 Caco-2细胞分别设立阴性对照组、LPS刺激组(分别为LPS组、Vector+LPS组、WT-sdc-1+LPS组及uS-sdcl+LPS组),转染24小时后加入1ug/ml的LPS刺激24h,分别提取总蛋白,浆蛋白及核蛋白,用Western blot检测P65在各个处理组的总蛋白,浆蛋白及核蛋白中的表达情况,检测IκBα在2种细胞总蛋白中的表达情况。 4.按上述方法将IEC-6、 Caco-2细胞分成5组,转染24小时后加入1ug/ml的LPS刺激,分别于0h、6h、12h、24h、48h收集5个处理组的培养上清,用ELISA检测TNF-α IL-1β、中性粒细胞趋化因子CINC-1的表达水平变化。 5.分离正常大鼠和人外周血的中性粒细胞,用Transwell小室模型检测LPS刺激后的上清中的CINC-1对中性粒细胞的趋化作用。以LPS刺激后CINC-1产生最多的时间点的培养上清作为下室的趋化因素,上室按0.5×106个／孔加入用10%胎牛血清的培养基重悬中性粒细胞,趋化24小时后按公式：(迁入下室中性粒细胞数+多聚碳酸酯膜上的细胞数)/上室加入中性粒细胞数×100%分别计算各处理组的迁移率。 6.本文数据均用均数±标准差表示,用SPSS13.0进行统计分析。若样本服从正态分布,进行多个独立样本的单因素方差分析。方差齐时用LSD检验进行多重比较；方差不齐时用Welch值代替F值,用Dunnett's T3检验进行多重比较,若不服从正态分布,进行多个样本的非参数检验。P0.05为差异有统计学意义。每一个实验结果至少重复三次。结果 1.真核表达载体pcDNA3.0-WT-sdc-1片段测序的结果,与GenBank中的syndecan-1基因序列相比完全一致,无突变；真核表达载体pcDNA3.0-unshedding-sdc-1目的突变点已成功发生突变,其余序列除了一处无义突变外,与GenBank中的syndecan-1基因序列完全一致,无突变。 2.PMA刺激前,Control组和Vector组几乎不表达Syndecan-1。 WT-sdc-1和uS-sdc-1转染组细胞均强表达Syndecan-1mRMA和蛋白,细胞上清中仅检测出少量脱落的Syndecan-1。PMA刺激后,各组mRMA表达无显著改变；WT-sdc-1转染组Syndecan-1的荧光强度较uS-sdc-1转染组显著减弱。上清中脱落的Syndecan-1含量显著增加。 3. IEC-6、 Caco-2细胞各个处理组加LPS刺激,总蛋白中P65的表达在各个处理组间有显著性差异(P0.05)。 Control组低于任何一个LPS刺激组。WT-sdc-1+LPS组和uS-sdc-1+LPS组均显著低于LPS组及Vector+LPS组,(P0.05)。 uS-sdc-1+LPS组的P65表达量较WT-sdcl+LPS组减少。IκBα在2种细胞总蛋白中的表达趋势与P65相同。 4.2种细胞浆蛋白中P65的表达在各个处理组间存在显著性差异(P0.05)。Control组仅有微弱的目的条带,LPS组和Vector+LPS组出现了较强的蛋白表达。目的条带灰度值/内参条带灰度值的比值差异无统计学意义(P0.05)。LPS组与WT-sdc-1+LPS组相比无统计学意义(P0.05)。但LPS组显著高于uS-sdc-1+LPS组(P0.05)。uS-sdc-1+LPS组与WT-sdc-1+LPS组相比无统计学意义(P0.05)。 5.2种细胞核蛋白中P65的表达在各个处理组间有显著性差异(P0.05)。Control组仅有微弱的目的蛋白条带,LPS组和Vector+LPS组出现了清晰的目的条带,目的条带/内参条带灰度值的比值差异无统计学意义(P0.05)。LPS组与WT-sdc-1+LPS组和uS-sdc-1+LPS组的比值相比有显著性差异。(P0.05)。uS-sdc-1+LPS组的比值与WT-sdc-1+LPS组相比无统计学意义(P0.05)。 6.从组间比较,2种细胞LPS处理组细胞培养上清中TNF-α水平较Control组显著增加(2种细胞的0h及Caco-2细胞的48h除外)(P0.05)。细胞表面Sydecan-1的表达量与TNF-α分泌量呈负相关,WT-sdc-1+LPS组与uS-sdc-1+LPS组的表达均小于LPS组和Vector+LPS组。uS-sdc-1+LPS组的TNF-α表达量较WT-sdc-1+LPS减少。从时间上比较,在0h至12h范围内,TNF-α分泌呈现增长趋势,12-24h分泌趋近平台期,24-48h分泌出现下降。 7.LPS刺激12h和48h时,IEC-6细胞uS-sdc-1+LPS组上清液中IL-1β的浓度最高,WT-sdc-1+LPS组的IL-1p浓度仅次于uS-sdc-1+LPS组。Control组IL-1p的浓度最低。刺激0h、6h、24h时各组之间差异均无统计学意义(P0.05)。Caco-2细胞产生的IL-1p在相同的时间点内,各个处理组之间的差异均无统计学意义(P0.05)。 8.LPS刺激后,IEC-6细胞分泌的CINC-1在相同的时间点内(0h除外)进行比较,Control组的CINC-1浓度低于任何一个LPS刺激组。WT-sdc-1+LPS组的CINC-1分泌量较IEC-6+LPS组和Vector+LPS组减低,差异具有统计学意义(P0.05)而uS-sdc-1+LPS组与WT-sdc-1+LPS组比较,uS-sdc-1+LPS组的CINC-1显著低于WT-sdc-1+LPS组(P0.05)。Caco-2细胞分泌的CINC-1在0h、6h、12h时各组间相比无统计学差异(P0.05),在24h和48h时CINC-1在各组间差异与IEC-6细胞的相同。在0-48h内,IEC-6产生的CINC-1的浓度总体上有随着时间增长而增加的趋势Caco-2细胞产生的CINC-1在0h至12h范围内,CINC-1分泌呈现增长趋势,12-24h分泌趋近平台期,24-48h分泌出现下降。Transwell各组迁移率与ELISA结果相符。结论 1.成功构建了pcDNA3.0-wildtype-syndecan-1载体和pcDNA3.0-unshedding-syndecan-1载体,pcDNA3.0-unshedding-syndecan-1载体在PMA刺激后确实可达到不脱落的效果。为研究syndecan-1在临床IBD中的作用机制及基因治疗奠定了基础。 2.高表达的Syndecan-1可使NF-κB信号通路的表达及活性均下降,不脱落的Syndecan-1作用更为明显,NF-κB信号通路是炎症因子产生的上游,Syndecan-1可能通过抑制NF-κB信号通路发挥抗炎作用。 3.Syndecan-1表达增高可使炎症因子TNF-α、 CINC-1的表达减少,不脱落的Syndecan-1作用较正常高表达的Syndecan-1更为明显。Syndecan-1可通过抑制中性粒细胞的迁移及TNF-α、CINC-1的表达来抑制肠道炎症程度。 4.高表达的Syndecan-1并不能减低LPS刺激下IL-1β的表达。IL-1p的调控错综复杂,Syndecan-1可能不是通过调节IL-1p的表达来影响炎症反应的。 5. Syndecan-1的表达增强或脱落减少可通过抑制炎症信号通路的活性和减少炎症因子的分泌而减轻炎症的进程。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R574

【参考文献】