内毒素致肾髓质上皮细胞损伤与水通道蛋白2表达的关系

发布时间：2020-04-26 07:45

【摘要】： 目的 肠屏障损伤导致内毒素入血是梗阻性黄疸时肾功能损害的重要的病理生理机制之一。既往本课题组通过研究大鼠梗阻性黄疸动物实验时发现,梗阻性黄疸时,肾集合管上皮细胞中AQP2的表达显著降低。本实验拟在细胞水平上明确内毒素对大鼠肾髓质上皮细胞的影响,以及水通道蛋白2表达的变化。 方法 培养并传代大鼠肾髓质上皮细胞系mIMCD-3,选取处于指数生长期的细胞制作细胞爬片,免疫组化DAB染色法检测水通道蛋白2在大鼠肾髓质上皮细胞mIMCD-3的表达及定位。分别用终浓度为0.1,0.5,1,5,10μg/L的内毒素与大鼠肾髓质上皮细胞mIMCD-3培养12h,24h,48h,72h后用CCK-8检测吸光度,计算细胞抑制率。选取作用明显的终浓度为10μg/L的内毒素作用于mlMCD-3后分别在4h,12h,24h,48h用流式细胞仪检测凋亡。用同一浓度的内毒素培养mlMCD-3在4h,24h后用免疫组化DAB染色法检测水通道蛋白2的表达情况,并做光密度分析。所有计数资料均用均数±标准差形式表示,运用统计软件SPSS13.0进行单因素的方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。 结果 mIMCD-3表达AQP2。培养并制作细胞爬片后,用免疫组化和DAB染色可见,细胞胞浆中大量棕红色颗粒,呈片或呈堆积状排列,证明mIMCD-3表达AQP2,并且在基础状态下的AQP2主要定位于细胞浆中。同时行阴性对照的细胞做免疫组化时,没有添加特异性结合的一抗,用DAB染色后胞浆中无棕红色颗粒生成,整个胞浆为苏木素淡染的蓝色,排除了AQP2表达的假阳性的存在。 LPS抑制肾髓质上皮细胞mIMCD-3增殖。不同浓度分别做单因素方差分析,具有统计学差异(P＜0.05)。做组间两两分析时,12小时0.5μg/L和1μg/L,5μg/L和10μg/L;24小时0.5μg/L和1μg/L;72小时0.1μg/L和0.5μg/L,0.5μg/L和1μg/L,1μg/L和5μg/L,5μg/L和10μg/L比较,不具有统计学差异(P＞0.05)。证明浓度低于5μg/L时,LPS的浓度变化对细胞增殖的抑制作用差别不大,增大浓度梯度时,LPS对细胞的抑制作用明显增强,具有浓度依赖性。浓度为0.1μg/L的LPS在对细胞作用的早期,对细胞不仅没有抑制,反而有增殖的作用。当作用时间增加到72小时时,相邻浓度组间的比较不具有统计学差异,各组间细胞的抑制率无差别。不同时间组分别行单因素方差比较,具有统计学差异(P＜0.05)。但0.1μg/L组12小时和24小时,0.5μg/L组12小时和24小时,24小时和48小时比较,1μg/L组12小时和24小时比较,不具有统计学差异(P＞0.05)。证明浓度低于1μg/L时,细胞的抑制率随时间变化不大。浓度大于等于5μg/L时,任意两两组间对比均具有统计学差异。LPS对mIMCD-3的抑制作用具有时间依赖性。 LPS诱导肾髓质上皮细胞mIMCD-3凋亡。将终浓度为10μg/L的LPS溶液作用于肾髓质上皮细胞mIMCD-3 0h,4h,24h和48h后,经流式细胞仪检测,结果表明,LPS对mIMCD-3的抑制作用主要表现为细胞凋亡,随作用时间的延长,细胞凋亡增加(P＜0.01),同时作用时间和凋亡率具有直线相关性(R=0.9920)。 对肾髓质上皮细胞mIMCD-3行组化染色可以看出,AQP2的表达主要位于细胞质,表现为棕黄粗大的颗粒成片或成堆排列。LPS作用于mIMCD-3后,AQP的表达下调,细胞中棕黄色颗粒变稀疏,且颜色变浅。浓度为10μg/L的LPS作用细胞0小时,4小时和24小时的平均光密度分析,总体比较具有统计学差异(P＜0.01)。但组间作用时间4小时和0小时比较,不具有统计学差异(P=0.897),24小时组和4小时组比较,24组和0小时组比较,明显具有统计学差异(P＜0.01)。证明在短时间内,时间小于4小时,LPS对AQP2表达的变化没有影响,但随LPS作用时间的延长,AQP2的表达下降。 结论 mIMCD-3表达AQP2,基础状态下的AQP2主要定位于细胞浆中。LPS抑制mIMCD-3增殖,具有时间依赖性和剂量依赖性。LPS对细胞增殖的抑制作用主要表现为诱导细胞凋亡。随作用时间延长,细胞凋亡率增加,两者具有直线相关。LPS介导的肾髓质上皮细胞凋亡通路中,AQP2起重要作用。
【图文】：

、.AQPZ在肾髓质上皮细胞中的表达，阳性对照图(S一P法x4红色的颗粒即为AQPZ的表达。细胞胞浆中大量棕红色颗列，证明mIMCD一3表达AQPZ，并且在基础状态下的AQP中。

.AQPZ在肾髓质上皮细胞中的表达，阴性对照图(S一P法x400素淡染的蓝色，无棕红色颗粒。行阴性对照的细胞做免疫组化性结合的一抗，用DAB染色后胞浆中无棕红色颗粒生成，，排除阳性的存在。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R575;R692

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