mHSF2的原核表达载体构建、蛋白纯化及功能研究
发布时间：2020-04-26 13:42
【摘要】：[目的]构建mHSF2原核表达载体,纯化mHSF2重组蛋白并研究其在体外是否具有生物活性,能否进入细胞发挥生物学功能。[方法]以mHSF2为模板,PCR法扩增出全长mHSF2编码系列,用BamHI和xhoI对纯化产物和pET-28a载体进行双酶切,采用基因重组技术将mHSF2片段插入至pET-28a原核表达载体中。测序正确后,将pET-28a-mHSF2重组质粒转入BL21中,利用IPTG诱导宿主菌表达mHSF2,考马斯亮蓝染色及Western Blot鉴定重组蛋白;用Ni-NTA亲和层析法分离重组蛋白,EMSA鉴定纯化重组蛋白是否具有生物活性;重组蛋白干预Raw246.7细胞,提取细胞总蛋白,Western Blot评估重组蛋白能否进入细胞发挥生物学功能。[结果]将鼠全长HSF2编码序列克隆到原核表达载体中,BamHI和xhoI酶切鉴定片段约为1500bp,且pET-28a-mHSF2重组质粒测序正确。重组质粒转染BL21大肠杆菌后在IPTG诱导下可表达mHSF2。原核表达重组蛋白能与His抗体及HSF2抗体特异性结合,鉴定重组蛋白为mHSF2;EMSA检测mHSF2与HSE结合情况,鉴定原核表达mHSF2具有生物活性;用重组蛋白干预Raw246.7细胞后发现,mHSF2能进入细胞发挥功能。[结论]利用基因工程技术构建了 pET-28a-mHSF2原核表达载体并表达可溶性mHSF2;原核表达所得到的mHSF2具有生物学功能,并可进入细胞内,为本课题组后续研究HSF2奠定实验基础。
【图文】：
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本文编号：2641559
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