不同时期异体骨髓间充质干细胞移植对大鼠肝纤维化的作用

发布时间：2020-04-26 13:39

【摘要】： 目的 肝纤维化是多数终末期肝病发展的共同阶段,这一阶段如果得不到有效治疗,将会发展为肝硬化,甚至导致患者死亡。对于终末期肝病,原位肝移植(Orthotopic liver t ransplantation, OLT)理论上是最理想的治疗方法,但是供体的缺乏及术后免疫排斥反应与高额的医疗费用又成了一个新的问题,即使更新的异位肝移植和原位部分肝移植也存在同样的问题,因此必须寻找其他可能的解决办法。干细胞在一定条件下可以分化为肝样细胞,并补充纤维化过程中损伤的肝细胞,从而在一定程度上逆转和延缓肝纤维化,且不存在免疫排斥,为临床终末期肝病治疗提供了新的思路。 鉴于此,本实验以体外分离培养骨髓间充质干细胞(Bone mesenehymal stem cells, BMSCs)和建立肝硬化动物模型为基础,通过尾静脉输注BMSCs来检测其是否可以改善受损肝脏的肝功能,并探索最佳移植时期,为BMSCs临床治疗肝硬化的可行性提供实验依据。 方法 1.体重200-250gSD大鼠60只,设正常对照组(n=10),普食普水； 2.应用40%CCl4油溶液0.3ml／100g皮下注射,以10%酒精为唯一饮用水,诱导大鼠肝硬化模型； 3.取正常健康5周龄大鼠股骨骨髓,贴壁培养法分离培养MSCs并传代扩增,获得足够量的供移植用MSCs悬液； 4.将培养得到的的健康SD大鼠MSC用DAPI标记,分别于肝硬化造模的第6周,10周经尾静脉注射1×106MSCs; 5.在移植4周后,评价移植组与对照组的生存状态,观察肝脏的大体改变及肝脏的重量,行肝功能检测(ALB.ALT.TBIL.),取肝脏做病理检查,荧光显微镜下观察,了解BMSCs在肝内的整合情况； 6.收集,记录数据,做出统计分析。 结果 1.成功培养出了BMSCs,相差显微镜下,新分离的骨髓单个核细胞透亮度好,大小不一,悬浮于培养液中,第3天换液后,可见少量短梭形、星形细胞分散贴壁生长,贴壁后细胞开始分裂增殖,贴壁细胞体积增大,呈现成纤维细胞梭形外观； 2.皮下注射40%CCl4油溶液8周后,大鼠精神差,进食减少,体重明显降低(283±19 vs 335±16g),剖腹后可从腹腔抽出5ml左右清亮腹水,肝脏外观稍肿大(13±1.69 vs 10.02±1.06g),呈不均匀的暗红色,表面可见大量点状坏死。生化指标与正常对照组相比：ALT(336.25±6.25 vs 37.67±14.35IU／L,P0.01),ALB(23.13±1.56 vs 33.13±1.51g／L,P0.01),TBIL(16.14±1.28 vs 0.93+0.55μmol／L,P0.01)。 HE染色示：正常肝小叶结构消失,被假小叶所取代,肝细胞有不同程度的脂肪浸润、片状坏死,同时可见炎性细胞浸润； 3.MSCs经尾静脉移植入肝硬化大鼠后,6周移植组,10移植组大鼠肝功能较对照组均明显改善,ALT(97±17.35,180±19.68 vs 336.25±6.25IU／L,P0.01),ALB(30.81±1.30,28.8±1.82 vs 23.13±1.56g／L,P0.01),TBIL(13.42±0.82,14.91±1.18 vs16.14±1.28μmol／L,P0.01),P0.05与对照组相比有统计学意义,其中6周移植组较10周移植组效果更佳(F=2.86,P0.05),体重也有所增加(324±17 vs 302±21g)。 病理检查结果示：MSCs6周移植组肝内胶原纤维增生程度明显减轻,尽管假小叶仍然存在,但小叶周围和小叶内的胶原纤维明显减少,10周移植组肝组织部分恢复,但仍然可见损伤细胞、出血和炎性浸润。 结论 1.全骨髓贴壁培养法适合大鼠骨髓MSCs的培养,具有简便、经济、细胞获得率高等特点,且第三代细胞仍有很强的增值能力,达到了移植要求； 2.采用联合酒精的四氯化碳复合法,CCl4与豆油混合成40%的浓度,每周皮下注射两次,在第8周大鼠肝的广泛区域观察到了假小叶,且成模率高,死亡率低,具有简便、快捷、高效等优点,适于制作大批量肝硬化模型； 3.DAPI用来标记、跟踪细胞的生长、整合情况是可行的； 4.体外传代培养的骨髓MSCs具有免疫耐受性,同种异体移植后无免疫排斥； 5.MSCs移植能够改善肝细胞的合成、代谢功能,改善大鼠外周血液的血生化特性和肝的组织学结构,且在肝纤维化早期进行移植效果更优。
【图文】：

形、星形细胞分散贴壁生长，伸出伪足呈逗点状或短棒状(见图2)。贴壁后细胞开始分裂增殖，贴壁细胞体积增大，呈现成纤维细胞梭形外观，有些细胞则呈三角形或多角形，核居中，有1~2个核仁(见图3)。传代时几乎呈均一的成纤维细胞样细胞，可呈网状、辐射状。(见图4)。各代干细胞详见附图。图1原代粥Cs。(X10O)图2第一代招Cs。(X100)图3第二代璐Cs。 (X100)图4第三代璐Cs。(X100)

贴壁细胞体积增大，呈现成纤维细胞梭形外观，有些细胞则呈三角形或多角形，核居中，，有1~2个核仁(见图3)。传代时几乎呈均一的成纤维细胞样细胞，可呈网状、辐射状。(见图4)。各代干细胞详见附图。图1原代粥Cs。(X10O)图2第一代招Cs。(X100)图3第二代璐Cs。 (X100)图4第三代璐Cs。(X100)
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R575.2

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本文编号：2641557