中缝背核nesfatin-1对大鼠内脏敏感性的影响及可能机制研究

发布时间：2020-04-28 08:42

【摘要】：【背景】肠易激综合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是以慢性反复发作腹痛以及排便习惯的改变为特征的功能性胃肠道疾病,临床检查无明显器质性改变。尽管是一种较为常见的肠道疾病,它对患者的生活质量以及工作造成了严重的影响。IBS的病生理学机制目前仍未完全明确,普遍认为内脏高敏感是其主要的发病机制之一。5-HT(5-hydroxytryptamine)与IBS患者内脏高敏感密切相关,5-HT受体拮抗剂以及三环类抗抑郁药对IBS的治疗作用提示中枢5-HT系统在IBS内脏感觉过敏发病机制中起重要作用。有研究报道,母婴分离内脏高敏感大鼠结直肠扩张后中缝背核(dorsal raphe nucleus,DRN)5-HT能神经元激活数目较正常对照组明显增加,电针可以通过降低中缝背核5-HT神经元的高表达而减轻母婴分离大鼠内脏高敏感性,提示中缝背核5-HT神经元在内脏疼痛调控中有很重要的作用。Nesfatin-1是由核组蛋白2(nucleobindin 2,NUCB2)裂解后产生的一种厌食肽。除了具有抑制摄食作用外,我们的前期研究还发现nesfatin-1与内脏高敏感有关。Nesfatin-1在中缝背核与5-HT共表达,母婴分离大鼠通过中缝背核5-HT高表达导致内脏高敏感,侧脑室注射nesfatin-1可以激活中缝背核5-HT能神经元,因此我们推测中缝背核nesfatin-1可能通过激活5-HT途径增加内脏高敏感。本研究采用新生期母婴分离大鼠内脏高敏感模型,中缝背核5-HT及色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase,TPH,5-HT合成限速酶)免疫阳性神经元代表中缝背核5-HT神经元,初步探讨中缝背核的nesfatin-1对大鼠内脏敏感性的影响及可能的机制。【研究目的】采用新生期母婴分离方法来建立大鼠的内脏高敏感模型,初步探讨中缝背核nesfatin-1对大鼠内脏敏感性的影响及可能的机制。【方法】1.新生雄性SD大鼠被随机分成母婴分离组和正常对照组,从出生后的第2-21天,母婴分离组组大鼠每天将其与母鼠分开3h,具体操作方法如下:每天早上8:00到11:00之间,将幼鼠从其母鼠笼中取出,置于另外一个鼠笼中,并将该鼠笼放在另外一个房间,使其与母鼠分离,其余时间幼鼠与母鼠共笼饲养。而正常对照组大鼠不与母鼠分离。在出生后第3周和第8周分别观察两组大鼠体质量的变化情况。2.通过检测大鼠在不同结直肠扩张压力(20 mmHg、40 mmHg、60 mmHg和80mmHg)刺激下的腹壁撤退反射(abdominal withdrawal reflex,AWR)评分和腹外斜肌肌电图(electromyographic,EMG)曲线下面积(area under the curve,AUC)来评估大鼠的内脏敏感性。3.出生8周时观察母婴分离组和正常对照组大鼠在不同强度结直肠扩张压力刺激时的AWR评分和腹外斜肌EMG曲线下面积,然后用免疫组化方法比较两组大鼠中缝背核nesfatin-1/NUCB2以及TPH的表达。4.取母婴分离大鼠随机分成2组,分别给予抗nesfatin-1/NUCB2抗体或溶剂对照中缝背核内注射,2h后分别检测该2组大鼠在结直肠扩张刺激时AWR评分和EMG曲线下面积,然后用免疫组化方法比较2组大鼠中缝背核5-HT以及TPH的表达情况。5.取正常大鼠随机分成2组,分别给予nesfatin-1或溶剂对照中缝背核内注射,连续注射7天,第7天时观察2组大鼠在结直肠扩张刺激时的AWR评分和EMG曲线下面积,然后用免疫组化方法比较2组大鼠中缝背核5-HT以及TPH的表达情况。【结果】1.母婴分离组大鼠在出生后第3周时的体重和正常对照组无明显差别(P0.05),而出生后第8周时的体重则要明显低于正常对照组大鼠,两者之间的差异具有统计学意义(P0.05)。2.在结直肠扩张压力分别为40、60和80mmHg时,母婴分离组大鼠的AWR评分以及EMG曲线下面积均明显高于正常对照组(P0.05)。3.母婴分离组大鼠中缝背核中nesfatin-1/NUCB2及TPH免疫反应阳性细胞数均明显高于正常对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。4.母婴分离大鼠中缝背核内注射抗nesfatin-1/NUCB2抗体后,在结直肠扩张压力为40、60和80mmHg时的AWR评分及各个压力下的EMG曲线下面积均明显低于溶剂对照组(P0.05),并且中缝背核中5-HT和TPH免疫反应阳性神经元的数量也明显下降(P0.05)。5.正常对照大鼠中缝背核内注射nesfatin-1后,在结直肠扩张压力为40、60和80mmHg时的AWR评分和EMG曲线下面积均明显高于溶剂对照组(P0.05);并且中缝背核中5-HT及TPH免疫反应阳性神经元的数量也显著增加(P0.05)。【结论】中缝背核nesfatin-1参与了大鼠内脏高敏感的发生,潜在机制可能与激活中缝背核5-HT能神经元有关。
【图文】：

用浓度为 10%的水合氯醛（0.3ml/100g wt，IP）麻醉大鼠，进行 DRN 核团内微注射导管埋置术。将大鼠头部置于脑立体定位仪上，通过调节门齿杆和耳杆使颅骨保持平行；将大鼠头部的部分毛发剃除，头部皮肤经碘伏消毒后酒精脱碘，用经过高压消毒的眼科手术剪轻轻剪开大鼠头部皮肤，呈长约 1.5cm 矢状切口，棉签逐层分离皮下组织到达颅骨膜；用蘸有少量双氧水的棉签轻轻涂抹颅骨表面，暴露出前囟（Bregma）及人字点，在立体定位仪引导下 DRN 核团内置入微注射导管，坐标参照 George Paxinos＆Charles Watson 大鼠脑立体定位图谱第五版【58】，DRN 坐标：前囟（Bregma）后 8mm；左侧/右侧 0mm；深度为5.8mm。用颅骨钻在导管的前方两侧分别钻两个小孔，使两个小孔和导管之间构成一个三角形，注意钻孔时动作要轻柔避免伤及脑实质，孔径不宜过大，将两枚不锈钢螺丝钉置于小孔内，然后用牙科水泥覆盖以固定导管。手术结束后分别对大鼠进行编号，置于单独的鼠笼中以避免相互破坏手术部位，手术后大鼠恢复一周。

图 2 微注射导管位于中缝背核内 （Aq：中脑导水管； DRN：中缝背核）数据统计验数据采用 SPSS24.0 软件进行统计分析处理，所有的实验数据均采用准差（Mean±SD）来表示，结直肠扩张后内脏敏感性（包括大鼠测得的 以及腹外斜肌 EMG 曲线下面积）采用双因素重复测量方差分析进行统若有差异，，则用 Bonferroni 事后检定进行两两比较。中缝背核免疫阳性量的比较则运用独立样本的 t 检验，P <0.05 认为各组间的差异有统计
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R574

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