活细胞内示踪乙型肝炎病毒的实验研究

发布时间：2020-04-29 06:32

【摘要】： 经绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)标记后的病毒，可以在活细胞中显示并研究它们。但GFP并不适合标记乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，因为HBV是一种体积较小的病毒体，它的内部空间狭小，无法容纳GFP这样一个含有238个氨基酸的大片段的掺入。最近有报道称：融合了四半胱氨酸标签(tetracysteine tag，TC tag)的目的蛋白可以被一种双砷荧光染料在活细胞中特异地标记。这种双砷标记技术为活细胞中HBV的荧光示踪和研究又提供了新的机遇。 【目的】制造重组的经双砷染料标记的荧光HBV，从而在活细胞中示踪并研究HBV。 【方法】应用分子克隆和PCR定点突变技术，以含1.3倍HBV基因组的载体为模板，在其编码的核心蛋白的免疫优势c／el表位(the immunodominant c／el site)附近插入一个特殊的TC标签，这个标签可以同双砷荧光染料特异地结合。构建所得的重组的HBV载体被转染入HepG2细胞中用于表达TC嵌合型核心蛋白。应用Westernblotting，免疫荧光以及双砷标记分析这种蛋白的表达和亚细胞定位。此外，表达这种TC嵌合型核心蛋白的细胞用双砷染料印迹后，继续被培养，用于制造荧光HBV病毒体。应用投射电子显微镜(transmission electron microscopy，TEM)和激光共聚焦显微镜鉴定荧光HBV病毒体的产生，并进一步调查这些荧光病毒对DMSO处理过的HepG2细胞的感染性。最终，应用激光共聚焦显微镜在活细胞中直接观察荧光HBV的转运。 【结果】编码TC嵌合型核心蛋白的HBV载体被成功构建，转染了这些HBV载体的细胞可以表达TC嵌合型核心蛋白并制造成熟的HBV病毒体。而且，细胞中结合了双砷染料的TC嵌合型核心蛋白可以特异地发出荧光，并组装入HBV核心颗粒中进而形成荧光HBV病毒体，这些病毒体保留了同野生型HBV病毒体类似的感染性。这些荧光HBV在活细胞中的转运可以通过激光共聚焦显微镜，直观而便捷地观察到。 【结论】本研究应用双砷标记技术，，首次制造出了荧光HBV病毒体，它让我们可以在活细胞中示踪并研究HBV的转运。这种荧光HBV可以作为一种非常有价值的工具，用于在活细胞中深入地研究HBV生命周期中的动态过程以及病毒与宿主之间的相互作用。
【图文】：

图1编码TC嵌合型核心蛋白的HBV载体的构建1.3倍HBV基因组的载体，HBV各基因区己被示出。KP，，I和E被引入到pTHBV1.3的HBVC基因中，再将编码TC标签的寡核个位点间，构建出编码TC嵌合型核心蛋白的HBV载体。ConstruetionofHBVveetoreneodingTCtaggedeoreProteinmidPTHBVI.315arePlieationeomPetentPlasmideontaininga1.chgenesregionofHBVinthePlasmidPTHBVI.3wasindieatedlandEeoRV，wereintrodueedintoHBVeoregeneofthePoligonueleotideseneodingTCtagwereelonedintotheKP，;1andEBVveetorseneodingTC砚aggedeoreProteinwereeonstrueted.

pTHBVI.3翎TCI的图谱
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R512.62

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本文编号：2644318