肠上皮剪接体蛋白Eftud2对UC的调控与机制研究

发布时间：2020-04-29 06:26

【摘要】：目的溃疡性结肠炎(UC)是一种侵袭结肠黏膜的炎症,目前病因尚不明确,具有难治愈、易复发,易癌变的特点。UC的病因尚未明确,越来越多的研究显示肠上皮细胞(IEC)在UC中具有重要的调控作用。肠上皮细胞的功能具有多样性,可在肠道表面形成紧密连接,构成肠道与外界环境的生理性屏障,还可分泌粘蛋白等进一步阻止病原微生物的入侵。IEC细胞上表达模式识别受体(PRR)可识别肠道微生物的刺激,从而激发炎症反应,并且能分泌一系列细胞因子,调节肠道微环境。前期的研究中,我们通过观察UC/CAC(Colitis associated cancer)小鼠模型炎症癌变的过程,发现其中Eftud2蛋白表达明显上调。Eftud2是剪接体蛋白U5的组成成分,能够促进前体RNA剪接为成熟的RNA。Eftud2也可在免疫反应中发挥调节作用,能够调节细胞因子分泌,还可影响MyD88信号通路。本实验意在探究Eftud2能否通过调节肠上皮细胞的功能,进而影响UC的发生发展。方法使用Cre/Loxp系统建立肠上皮特异性敲除Eftud2的小鼠模型,分别在体内、外进行机制的研究与探索。体外研究中,分选Eftud2特异性敲除小鼠的肠上皮细胞,经LPS刺激后用ELISA法检测其炎症相关细胞因子释放;Western Blot法检测NF-κB信号通路有关蛋白的表达与正常小鼠肠上皮细胞是否存在差异。体内研究中,在生理情况下检测Eftud2对肠上皮细胞的屏障功能及肠上皮细胞的生长是否有影响;建立DSS诱导的UC模型,在病理情况下检测UC相关评价指标及病理表型是否存在差异。结果通过Western Blot和组化实验验证,证实肠上皮特异性敲除Eftud2小鼠模型建立成功。体外实验结果显示,经LPS刺激后,Eftud2特异性敲除的肠上皮细胞与正常肠上皮细胞相比,IL-1β、IL-6、IL-17A和TNF-α四种细胞因子的释放无显著性差异,NF-κB p65亚基磷酸化水平也没有显著性差异。体内实验结果表明,Eftud2特异性敲除的小鼠肠上皮细胞生长未见异常;在DSS诱导的UC模型中,肠上皮特异性敲除Eftud2的小鼠与野生型小鼠在体重下降、摄食量下降、死亡率、便血情况及肠道损伤程度等UC的评价指标中均无显著性差异。综上,我们的研究结果表明,Eftud2未能通过影响肠上皮细胞的功能而影响UC进程。
【图文】：

示意图,作用原理,示意图,重组酶

一、肠上皮特异性敲除 Eftud2 小鼠的构建与鉴定re-loxp 系统基本作用原理Cre 重组酶是大肠杆菌噬菌体 P1 中由 Cre 基因编码的 343 个氨基酸组成的质，它能够识别特异性 loxp 序列，并根据 loxp 序列的位置和方向介导特异组反应。Loxp序列是 Cre 重组酶的特异性识别位点，序列为：5’-TAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3’;3’-ATTGAAGCATATCG-TATGTAATATGCTTCAATA-5’。具有两个 13bp 反向序列和一个 8bp的不对称间隔序列，具有方向性。当两个 loxp 序列位于同一NA 链且方向相同时，，Cre 重组酶能够敲除 loxp 序列之间的 DNA 片段[6]。如-1 所示 Cre-loxp 作用原理。

示意图,小鼠,示意图,基因型

Eftud2loxp+/-小鼠自交，得到 F1 代小鼠经鉴定选取纯和 Eftud2lo 代小鼠与基因型为 Villincre+/-交配，得到 F2 代小鼠经鉴定选取基/-Eftud2loxp+/-的子代小鼠进行自交，最终得到实验用小鼠的基因/-Eftud2loxp+/+。将该小鼠与基因型为 Eftud2loxp+/+不携带 Cre 酶的组织特异性鉴定后即可用于实验。实验组小鼠基因型为 Villinp+/+，即肠上皮特异性敲除小鼠表示为 KO（Knockout）组，对 Eftud2loxp+/+，即不携带 Cre 基因的纯合 loxp 小鼠表示为 WT（。如图 1-2 所示小鼠交配方案及基因型示意图。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R574.62

【参考文献】