Tmub1蛋白通过抑制STAT3磷酸化负向调控肝细胞再生的实验研究

发布时间：2020-04-29 11:11

【摘要】：一、研究背景肝脏各种良恶性疾病常引起肝功能不同程度的损伤。特别在肝脏恶性肿瘤的手术治疗中,肝功能衰竭是患者术后死亡的一大原因,也是制约晚期肝癌患者进行手术治疗的难点之一。目前对于肝功能衰竭的治疗常用方法有非生物型人工肝支持治疗及肝移植,但这些技术仍存在诸多局限性,不能很好地解决术后肝功能衰竭的问题。而过去研究发现肝脏是一个具有强大的再生能力的器官,在部分肝切除术(partial hepatectomy,PH)后,肝脏能在较短期内通过自身的修复完全恢复自身体积和功能~([1]),因此人为调控肝脏再生使得肝脏恢复原有功能可作为一种治疗肝功能衰竭的有效手段。对于肝脏外科,若能有效调控肝脏再生,既可避免肝切除术后可能出现的肝功能衰竭问题,又可拓宽肝切除术的适应症,为肝脏疾病的治疗提供强有力的支持。因此,深入研究肝脏再生过程中肝细胞增殖机制及肝再生调控网络的作用是必不可少的。跨膜和泛素样结构域蛋白1(Tmub1),也被称为肝细胞临时穿梭蛋白(HOPS),是一个核质穿梭蛋白,包含一个泛素样结构域、一个出核信号和脯氨酸富集区~([2])。在肝再生过程的不同时间,Tmub1蛋白大量表达,并改变亚细胞定位,抑制肝细胞增殖~([3])。有文献报道,在肝细胞增殖过程中,转录因子C/EBPβ可增强Tmub1的表达~([3]);Tmub1沉默后导致中心体功能异常,引起细胞分裂失败和细胞周期阻滞~([4]),提示Tmub1可影响细胞周期进程~([5])。Tmub1参加了肝再生调控网络,但Tmub1在肝再生调控网络中起的作用及Tmub1对细胞增殖的影响机制尚未阐明。二、研究目的1.通过构建小鼠70%肝切除模型,并向小鼠转染异位表达Tmub1质粒,在体内层面明确Tmub1对肝再生和肝细胞增殖的影响。2.使用人正常肝细胞L02,明确Tmub1通过抑制STAT3磷酸化对肝细胞增殖的影响。3.探讨Tmub1与STAT3的相互作用机制。三、材料和方法1.构建小鼠70%肝切除再生模型,并分别于术前2天、术后1天通过尾静脉向小鼠体内转染Tmub1过表达质粒及阴性对照质粒,并设立假手术组(不行肝切除术,仅开腹并游离肝周韧带)。通过检测术后3天小鼠肝重/体重、血清AST/ALT水平,评估各组小鼠肝切除术后肝再生情况,使用Western Blotting技术检测增殖相关蛋白表达情况,并采用免疫组化和HE染色分析各组小鼠肝损伤情况和肝细胞增殖情况,明确Tmub1对小鼠肝再生的影响以及对STAT3通路相关蛋白表达量的影响。2.使用人Tmub1过表达质粒及shRNA,瞬时转染人正常肝细胞L02后通过EdU检测Tmub1异位表达对L02细胞增殖能力的影响,WB检测Tmub1异位表达对STAT3通路相关蛋白表达的影响,免疫荧光和WB检测Tmub1异位表达对STAT3和p-STAT3亚细胞定位的影响。3.通过相应Rescue实验,观察STAT3抑制剂stattic/激动剂OSM对Tmub1诱导的肝细胞增殖能力的逆转作用。4.通过生物信息学分析、染色质免疫沉淀技术(ChIP)及荧光素酶报告基因实验(Luciferase reporter gene assay)探讨STAT3对Tmub1表达的诱导作用,通过免疫共沉淀实验明确Tmub1与STAT3蛋白的相互作用。5.实验数据采用SPSS 19.0统计软件进行分析;计量资料结果以均数±标准差表示,两组间均数采用t检验进行比较。P0.05作为显著统计学差异的标准。四、结果1.在肝切除术后3天,过表达Tmub1的小鼠肝重/体重比显著低于阴性对照组及空白组小鼠,提示过表达Tmub1延缓了小鼠肝脏再生;血清转氨酶检测提示过表达Tmub1组小鼠血清ALT、AST水平显著高于对照组,提示肝功能恢复情况差;同时,免疫组化及HE染色示Tmub1过表达组小鼠肝细胞损伤更为严重,且增殖指标Ki-67、p-H3阳性率显著低于阴性对照组及空白组小鼠;进一步的Western Blotting结果提示STAT3磷酸化水平及MCM2、Cyclin D1的表达量在过表达Tmub1小鼠中明显降低,提示Tmub1显著抑制了肝再生过程中的肝细胞增殖。2.Western Blotting提示过表达Tmub1显著降低STAT3磷酸化水平及cyclin D1和c-myc的表达量而不影响STAT3总蛋白水平;反之干扰Tmub1表达后,STAT3磷酸化水平及cyclin D1和c-myc的表达量显著增高,但总STAT3表达量不变。免疫荧光提示Tmub1不影响STAT3的亚细胞定位。3.EdU细胞增殖实验提示,过表达Tmub1的人正常肝细胞L02增殖受到显著抑制,但在加入STAT3激动剂OSM后细胞增殖情况恢复;干扰Tmub1表达可显著促进L02细胞增殖,而该效应可被STAT3抑制剂stattic所回复。Western Blotting结果同样提示过表达Tmub1引起STAT3磷酸化水平及cyclin D1和c-myc的表达量降低,可在加入OSM之后恢复。反之亦然。4.生物信息学分析发现人的Tmub1基因启动子区域存在一个STAT3的结合位点。染色质免疫沉淀技术(ChIP)及荧光素酶报告基因实验(Luciferase reporter gene assay)提示STAT3可与Tmub1启动子相结合,并提高Tmub1启动子的活性、增强Tmub1的表达。5.利用免疫共沉淀技术(co-IP),我们发现Tmub1与STAT3可形成蛋白质复合物。五、结论Tmub1是一个肝再生的负相调控因子。STAT3可诱导Tmub1的基因表达,而Tmub1又可通过结合并抑制STAT3的磷酸化激活来发挥其对肝细胞增殖的抑制作用。Tmub1和STAT3可能形成了一个肝细胞增殖过程中的负反馈调控环路来调控肝再生的进程。
【图文】：

陆军军医大学硕士学位论文18图2.1 过表达Tmub1抑制小鼠肝切除术后肝脏再生。A：体内转染及肝部分切除术（PH）实验计划示意图；B: 在PH后3天后，Tmub1过表达组和阴性对照组小鼠肝体重比。以假手术组小鼠为对照；C：PH3天后，血清谷草转氨酶（AST）及谷丙转氨酶（ALT）水平。*：p < 0.05；**：p <0.01；***：p < 0.001。n=3。2.3.2 过表达 Tmub1 抑制增殖相关蛋白的表达我们将 PH 后 0 时及 3 天获得的再生肝组织进行 Western Blotting 检测及组织学分析。与对照组相比，通过体内转染过表达 Tmub1 质粒，，成功使小鼠肝脏内 Tmub1 表达量增加，过表达效果满意。而增殖相关蛋白，如微小染色体维持蛋白（MCM2）、磷酸化信号转导子和转录激活子 3（p-STAT3）、细胞周期蛋白 D1(cyclin D1)表达量降低（图 2.2）。由此可知，Tmub1 在体内抑制小鼠肝脏再生。

2.2 A：PH后0h和72h肝组织中Tmub1及增殖相关蛋白的Western blotting分析。B：g结果的灰度值统计图。**：p < 0.01；*** p < 0.001。n=3。.3.3 组织学分析提示过表达Tmub1组小鼠的增殖水平明显低于对照组织学分析也得到同样的结论，Tmub1 抑制了肝细胞的增殖。在 HE 染色Tmub1 组可见更多的退化肝细胞(肝细胞内脂质异常滞留)，Ki-67 免疫组 Tmub1 组的增殖水平明显低于对照组（图 2.3）。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575

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1 解景东;杨宝山;;肝再生机制研究现况[J];肝脏;2014年12期

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本文编号：2644512